Molekularna genetika

MOLEKULARNA GENETIKA

Molekularna genetika predstavlja naučnu disciplinu koja proučava

fenomene naslednosti i varijabilnosti bioloških sistema na nivou molekula. Prvi
začeci   ove   mlade   naučne   discipline   zasnovani   su   na   eksperimentima   urađenim
sredinom   četrdesetih   godina   ovog   veka   kada   se   došlo   do   indicija   da   DNK
predstavlja   materijalnu   osnovu   nasledne   supstance.   Sa   otkrićem   sekundarne
strukture   DNK   (Watson   i   Crick,   1953)   otpočeo   je   buran   razvoj   molekularne
genetike. Metode koje su korišćene u samom začetku uglavnom su preuzete iz
organske hemije, biohemije, fizičke hemije i kristalografije, da bi se kasnije razvile
specifične laboratorijske metode i tehnike.

Nakon Mendelovog otkrića partikularnog nasleđivanja, geni su analizirani

na osnovu načina njihove transmisije iz generacije u generaciju. Mada je ovim
studijama   osvetljena   priroda   nasleđivanja,   struktura   ili   molekularna   građa   gena
ostale su nepoznate. Kasnije studije utvrdile su preciznu korelaciju između načina
transmisije   gena   kroz   generacije   (rastavljanje   i   slobodno   kombinovanje)   i
ponašanja   hromozoma   tokom   redukcione   deobe   i   oplođenja.   Ovakvi   i   slični
eksperimenti   pružili   su   snažne   dokaze   da   su   geni   lokalizovani   obično   na
hromozomima. Tako se pri postavljanju pitanja šta predstavlja hemijsku osnovu
nasleđa,   otpočelo   sa   traženjem   odgovora   ispitivanjem   biohemijsog   sastava
hromozoma.

Bez obzira na hemijski sastav i građu nasledne supstance, bilo je jasno još u

doba Mendela, da genetički materijal mora da ispuni određene zahteve, koji
proističu iz tada već poznatih podataka o kontinuitetu vrsta i evolutivnim
promenama. Genetička informacija mora da ispuni dva ključna zahteva:

Genotipsku funkciju, odnosno sposobnost replikacije. Genetički materijal
mora   da   sadrži   biološki   korisnu   informaciju   u   stabilnoj   formi.   Ova
informacija mora da se verno prenosi  sa roditelja na potomstvo, odnosno
sa   jedne   ćelije   na   drugu   u   procesu   mitoze.   Istovremeno,   genetički
materijal   treba   da   bude   podložan   slučajnim   promenama,   u   skladu   sa
procesima biološke evolucije.

Fenotipsku funkciju, tj. ekspresiju gena. Genetički materijal mora da
kontroliše razviće fenotipa datog organizma u interakciji sa sredinom. To
znači da su neophodni određeni mehanizmi za očitavanje informacije i
njeno prevođenje do konkretnog fenotipa. Važno je istaći, malu ali veoma
važnu, razliku između molekula koji mogu stvarati samo sopstvene

kopije (npr. neki kristali) i nasledne supstance koja reguliše stvaranje ne
samo sopstvenih molekula već i druge molekule.

Hromozomi su sastavljeni uglavnom iz tri grupe makromolekula: DNK,

proteina i RNK. Tako su tokom prve polovine dvadesetog veka među naučnicima
postojala   neslaganja   koja   od   ove   tri   komponente   predstavlja   hemijsku   osnovu
nasledne   supstance.   Tokom   četrdesetih   i   početkom   pedesetih   godina   nekoliko
elegantnih   eksperimenata   definitivno   je   pokazalo   da   se   genetička   informacija
nalazi u molekulima DNK (kod nekih virusa, međutim, RNK je nosilac nasledne
informacije).

DNK KAO GENETIČKI MATERIJAL

Interesantno je da su postojali indirektni dokazi da je DNK materijalna

osnova nasledne supstance, još mnogo pre eksperimenata koji su to potvrdili. Pre
svega, znalo se da je DNK prevashodno lokalizovana u hromozomima, dok su
RNK i proteini prisutni u velikim količinama ne samo u jedru već i u citoplazmi.
Pored toga, utvrđeno je da postoji precizna korelacija između količine DNK po
ćeliji i broja hromozoma u datoj ćeliji (najupadljivija razlika uočena je između
somatskih i polnih ćelija). Konačno, molekularni sastav DNK isti je u svim
ćelijama jednog organizma, dok sastav proteina i RNK varira kvalitativno i
kvantitativno u istom organizmu, zavisno od ispitivanog tipa ćelija.

Mada su ovi indirektni dokazi sugerisali da je DNK nasledni materijal, još

uvek nije bilo pouzdanih dokaza. Prvi direktni dokaz da su molekuli DNK
hemijska osnova naslednog matrerijala publikovali su Avery, MacLeod i McCarty
1944. godine. Ova grupa autora ispitivala je patogenost bakterije

Streptococcus

pneumoniae

na miševima. Primetili su da postoje dva soja pneumokoka: patogeni

S   soj   i   nepatogeni   R   soj.   Bakterije   S   soja   u   odgovarajućoj   hranljivoj   podlozi
formiraju     velike,   glatke   (engl.   ”smooth”=   gladak)   kolonije   usled   prisustva
polisaharidne   kapsule.   Upravo   kapsula   oko   ćelija   S   soja   pruža   im   zaštitu   od
fagocitoze pomoću leukocita. Nasuprot tome, ćelije R soja nemaju polisaharidnu
kapsulu,   nisu   patogene   i   formiraju   rapave   (engl.”rough”=   rapav)   kolonije   na
medijumu sa agarom.

Frederick Griffith je pokazao još 1928. godine da istovremenim

ubrizgavanjem patogenog S soja prethodno inaktivisanog temperaturom sa živim
nepatogenim sojem R dovodi do oboljevanja i uginuća kod najvećeg broja

Mada je molekularni mehanizam transformacije prepušten daljim

istraživanjima, eksperimenti Avery i sar. predstavljaju prvu jasnu demonstraciju da
(bar u slučaju pneumokoka) DNK predstavlja hemijsku osnovu nasledne
supstance. Danas je poznato da se prilikom transformacije segment DNK iz soja S
koji nosi genetičku informaciju za sintezu kapsule fizički integriše u hromozom
recipijentne ćelije R soja putem rekombinacionog procesa.

Dodatne direktne dokaze o DNK kao genetičkom materijalu objavili su

Hershey   i   Chase   1952.   godine.   Objekat   istraživanja   u   ovom   slučaju   bio   je
bakteriofag   T2.   Iz   ranijih   eksperimenata   bilo   je   poznato   da   se   kompletna
reprodukcija   bakteriofaga  T2   odigrava   u   ćelijama

Escherichia coli

. Osnovu za

eksperiment Hershey i Chase-a predstavljao je podatak da bakteriofag T2 sadrži
oko 50% DNK i 50% proteina i, još važnije, da se u DNK nalazi fosfor a uopšte
nema sumpora, dok proteini sadrže sumpor, a nemaju fosfor. Tako su pomenuti
autori mogli specifično da obeleže fagnu DNK pri uzgoju u medijumu sa
radioaktivnim fosforom

P (umesto normalnog izotopa

P) ili proteine omotača

bakteriofaga T2 - pri uzgoju u medijumu sa radioaktivnim sumporom

S (umesto

normalnog izotopa

S). Posle adsorpcije faga T2 za površinu

E. coli

i izvesnog

vremena neophodnog za ubacivanje virusne DNK u ćeliju bakterije, Hershey i
Chase   su   izlagali   ispitivane   uzorke   snažnim   mehaničkim   silama.   Nakon   toga
uzorak   je   centrifugiran   pri   čemu   su   u   talogu   ostajale   bakterijske   ćelije,   a   u
supernatantu T2 fagi. Pri korišćenju T2 faga sa obeleženim proteinima, utvrđeno je
da glavnina radioaktiviteta od

S ostaje van bakterijskih ćelija, dok se nasuprot

tome pri upotrebi T2 faga sa obeleženom DNK aktivitet gotovo isključivo nalazi
unutar ćelija

coli

. Pošto se reprodukcija faga (sinteza fagne DNK i proteina)

odigrava unutar bakterijskih ćelija, dok samo fagna DNK (a ne i proteini) ulazi u
ćeliju,   autori   su   zaključili   da   DNK   sadrži   genetičku   informaciju.   Eksperiment
Hershey   i   Chase-a   (“Hershey-Chase   experiment”)   svojom   elegantnošću   i
jednostavnošću doprineo je afirmaciji do tada neprihvaćenih rezultata Avery i sar.
(1944)   i   predstavljao   je   snažan   podsticaj   Watson-u   i   Crick-u   u   radu   na
osvetljavanju sekundarne strukture DNK.

RNK JE GENETIČKI MATERIJAL NEKIH VIRUSA

Danas je poznato da DNK predstavlja materijalnu osnovu nasleđa kod svih

organizama, osim nekih virusa (tzv. “RNK virusi”). Jedan od prvih eksperimenata
koji je pokazao da RNK može da predstavlja genetički materijal virusa jeste tzv.

“eksperiment   rekonstitucije”   (Fraenkel-Conrat   i   Singer,   1957)   na   mozaičnom
virusu   duvana   (TMV,   od   engl.   “tobacco   mosaic   virus”).   TMV   je   mali   virus
sastavljen   iz   jednog   molekula   RNK   inkapsuliranog   proteinskim   omotačem.
Različiti sojevi TMV virusa mogu se detektovati na osnovu razlika u hemijskom
sastavu proteina omotača. Upotrebom adekvatnih hemijskih tretmana moguće je
rastaviti proteine omotača od molekula RNK. [taviše, ovaj proces je reverzibilan:
mešanjem proteina i RNK, pod određenim uslovima, mogu se “rekonstituisati”
kompletne infektivne virusne čestice. Fraenkel-Conrat i Singer su odvojili proteine
od RNK kod dva različita soja TMV i zatim su rekonstituisali “mešane” viruse
sastavljene od proteina jednog i RNK drugog soja TMV, i obratno. Kada su ovi
mešani virusi upotrebljeni da inficiraju lišće duvana, potomstvo virusa je uvek bilo
i genotipski i fenotipski identično sa parentalnim sojem od koga je dobijena RNK.
Prema tome, genetička informacija TMV nalazi se u RNK, a ne u proteinima (Sl.
2).

Sl 2- Dokaz da je genetički materijal kod TMV RNK, a ne protein

STRUKTURA NUKLEINSKIH KISELINA

Nukleinske kiseline su prvi put izolovane iz jedara limfocita (Miescher,

1869) i otuda potiče njihov naziv (jedro=nucleus). Međutim, biološki značaj
nukleinskih kiselina ostao je nepoznat sve do eksperimenata Avery i sar. (1944).

azotnih baza. Naime, kod DNK se nalaze adenin, guanin, citozin i timin, dok RNK
poseduje adenin, guanin, citozin i uracil . Konačno, RNK je obično jednolančani
molekul (mada se mogu, intralančano, formirati dvostruke zavojnice), dok DNK
poseduje dodatni nivo strukturne organizacije - obično je dvolančani molekul
(dvostruki heliks, zavojnica). Polinukleotidni lanci nastaju povezivanjem
nukleotida tzv. 5

-fosfoidestarskim vezama koje nastaju esterifikacijom fosfatne

kiseline sa OH grupom na 5

C atomu jednog nukleozida i OH grupom na 3

atomu susednog nukleozida (Sl. 5). Na jednom kraju polinukleotida najčešće se
nalazi fosfat vezan za 5

C atom (tzv. 5

kraj), dok se na suprotnom kraju nalazi

slobodna OH grupa sa 3

C atoma pentoze (tzv. 3

kraj).

Sl. 5 - Fragment poliribonukleotidnog lanca

Struktura DNK

Tačan model strukture DNK postavili su James Watson i Frensis Crick,

1953. godine, uglavnom na osnovu dve vrste podataka:

- Hemijske analize sastava DNK iz različitih izvora (Chargaff i sar.) ukazivale su
da je koncentracija timina uvek jednaka koncentraciji adenina, dok je koncentracija
citozina jednaka koncentraciji guanina. Ovaj podatak je neizbežno sugerisao da su
timin i adenin, kao i citozin i guanin prisutni u DNK u nekom fiksiranom
međuodnosu. Svakako, iz ovakvog odnosa jasno je da postoji ekvimolaran odnos
purina i pirimidina. Chargaffova pravila, u najkraćem, podrazumevaju da je:

A=T

G=C