Instrumentalne metode analize
farmaceutika
Seminarski rad: Fizičko hemijski principi
Profesor:
Studenti:
decembar 2016. godine
Sadržaj
1. Uvod.......................................................................................................3
2. Hromatografija........................................................................................4
2.1
Vrste hromatografskih metoda
......................................................5
2.2
Adsorpciona hromatografija
..........................................................7
2.3
Podeona (particiona) hromatografija
..............................................9
2.4
Podeona (particiona) hromatografija na tankom sloju......................11
3. Spektrometrija......................................................................................14
3.1
Masena spektrometrija
...............................................................14
3.2
Tehnike snimanja masenih spektara................................................16
3.3
PBM (Probability Based Matching) system…….....………………...17
4. Najcesce metode analize farmaceutika................................................17
4.1
Gasna hromatografija i masena spektrometrija................................18
4.2
Tečna hromatografija........................................................................19
5. Zaključak..............................................................................................21
6. Literatura..............................................................................................22
2
2. Hromatografija
Pod hromatografijom se danas podrazumeva skup analitičkih metoda za
analizu uzoraka, koji su po svojoj prirodi smeše komponenata, čija hemijska priroda
može biti slična, ali i vrlo različita. Pod analizom ovakvih uzoraka se do skora
podrazumevalo samo razdvajanje uzorka-smeše na njene sastavne komponente, ali
je uvođenje najsavremenijih tipova detektora proširilo osnovno značenje
hromatografije.
Hromatografija može biti analitička i preparativna. Preparativne
hromatografske metode se bave razdvajanjem komponenti smeše radi dalje analize i
smatraju se i metodom prečišćavanja. Sa druge strane analitičke hromatografske
metode, gde se radi sa relativno malim količinama uzorka, određuju procentualni
odnos komponenti neke smeše.
Naziv hromatografija potiče od grčke reči
hromos – što znači boja i grapheiri – pisati. Sam
pojam hromatografija datira još od početka 20. veka,
kada je ruski naučnik Cveti (slika1) proučavao zeleni
alkoholni ekstrakt iz lista. On usmerava svoju pažnju
na mogućnost adsorpcionog upijanja hlorofila od
strane tkiva lista. Cveti je razdvojio hlorofil na dve
komponente poznate kao hlorofil A i B na taj način što
je u staklenoj cevi (koloni) napunjenoj čvrstim
nosačem (kalcijumkarbonatom) na vrh kolone stavio
alkoholni ekstrakt hlorofila, a zatim lagano ispirao
kolonu petrol-etrom i tako zapoceo spiranje hlorofila.
Slika 1: Mihail Cvet (1872.-1919.)
Prilikom ispiranja, pojedine komponente biljnog ekstrakta kretale su se kroz
kolonu različitom brzinom i međusobno se razdvojile u obojene trake ili zone.
Pokazalo se da je apsorpcija dva hlorofila različita u odnosu na čvrst nosač, tako da
su se izdvojila dva sloja - dva hlorofila A i B. Pošto su razdvojene komponente bile
obojene Cveti je ovu metodu nazvao hromatografija. Cveti opisuje i obrazlaže
detaljno metod kojem daje naziv hromatografska analiza: „ Slicno sunčevim zracima
u spektru različitih komponenti složenog obojivaća raspoređuju se zakonomerno
jedan preko drugog na stubu upijača i postaju dostupni za kvalitativno i kvantitativno
određivanje.“ Cveti pravilno ocenjuje značaj metoda odvajanja i analize ne samo
obojenih, vec i bezbojnih materija. Trebalo je da prođe dosta vremena da bi se
shvatili značaj i mogućnosti otkrivene metode odvajanja.
Hromatografske metode spadaju u fizičko - hemijske metode analize, poput
spektroskopskih metoda (ultravioletne UV, infracrvene IC, masene MS, nuklearne
magnetne rezonance NMR) ili raznih standardnih instrumentalnih metoda
(polarimetrija, refraktometrija).
Krajem tridesetih godina prošlog veka razvijena je tankoslojna hromatografija,
a 1941. godine Marin i Synge dobili su Nobelovu nagradu za radove iz oblasti
hromatografije. Njihov fundamentalni rad postavio je osnove za razvoj tečne, gasne i
4
papirne hromatografije. Prvi rad iz gasne hromatografije publikovan je 1952 (Martin i
James), zatim se ova metoda razvila u veoma moćnu analitičku tehniku.
Tečna hromatografija se razvila šezdesetih godina prošlog veka, da bi se
danas izjednačila sa gasnom hromatografijom. Princip hromatografskog razdvajanja
smeše zasniva se na razlikama u raspodeli pojedinih komponenata smeše izmedu
pokretne i nepokretne faze. Sama raspodela posledica je raznih fizičko-hemijskih
procesa kao što su adsorpcija, desorpcija, apsorpcija, podela između dva rastvarača
i jonska izmena.
2.1 Vrste hromatografskih metoda
Zavisno od mehanizma interakcije između rastvorka i stacionarne faze
razlikuje se više vrsta hromatografskih metoda koji se nalaze u primeni. Za
industrijske uslove najviše se primenjuje adsorpciono–eluaciona hromatografija.
Većina ostalih hromatografskih postupaka imaju prvenstveno analitički značaj ili se
koriste za izdvajanje i prečišćavanje malih količina veoma skupih proizvoda.
Adsorpciona hromatografija (ADC) se naziva i eluaciona hromatografija.
Zasniva se na razlici među van der Valsovih sila, koje su karakteristične za slabo
polarna jedinjenja. Rastvorena supstanca sa slabijim van der Valsovim silama brže
se ispira (eluira) iz kolone. Kao punjenje kolone koriste se neorganski adsorbenti:
infuzorijska zemlja, aluminijumoksid, silikagel, aktivni ugalj i porozne organske smole
(na primer, Amberlite). Aktivni ugalj se obično koristi za uklanjanje pigmenata
(obezbojavanje) i bistrenje rastvora.
Tečno – tečna podeona hromatografija (LLC) je zasnovana na različitim
koeficijentima raspodele rastvorenih molekula između adsorpcione tečne faze i
protočne tečne faze. Najčešće je adsorpciona tečnost nepolarna.
Jonoizmenjivačka hromatografija (IEC) je zasnovana na reverzibilnom
vezivanju jedinjenja za aktivne suprotno naelektrisane grupe jonoizmenjivača, kojima
je napunjena kolona. Postoje kolone sa anjonskim i katjonskim jonoizmenjivačima.
Eluiranje se vrši rastvorom kiseline ili baze, zavisno od vrste punjenja kolone.
Afinitetna hromatografija (AFC) zasaniva se na visoko specifičnoj interakciji
između rastvorka i punjenja kolone, na primer, interakcija enzim – supstrat, enzim –
inhibitor, antigen – antitelo itd. Molekuli rastvorka (proizvoda) se vezuju za ligand
zahvaljujući specifičnom afinitetu. Ligand je imobilisan na čvrstom nosaču (matriksu).
Po završetku adsorpcije proizvoda kolona se ispira, a zatim se vrši eluiranje
proizvoda pogodnim hemijskim agensom: rastvorom sa određenim pH ili određenom
jonskom jačinom.
Gel–filtraciona hromatografija se naziva i hromatografija na molekulskim
sitima. Molekuli se razdvajaju na osnovu njihovih veličina, odakle naziv molekulsko
sito. Pri prolazu rastvora kroz kolonu samo molekuli koji su manjih dimenzija od
veličine pora u gelu mogu preći u gel, a veći molekuli prolaze kroz kolonu. Ispiranje
se vrši kontinualnim proticanjem čistog rastvarača kroz kolonu. Molekulska sita su
obično umreženi dekstrani (Sephadex), agaroze (Sepharose) ili poliakrilamidi (Bio-
Rad gelovi).
5
Prelazak komponente A iz jedne u drugu fazu traje do uspostavljanja
ravnoteže, pri kojoj odnos ravnotežnih koncentracija u stacionarnoj (c
s
) i mobilnoj (c
m
)
fazi dostiže konstantnu vrednost.
Konstanta ravnoteže ove reakcije K, naziva se koeficijent raspodele ili
particioni koeficijent i dobija se primenom Nernstovog zakona raspodele (jednačina
2):
(2)
Komponenta smeše koja ima veći afinitet prema stacionarnoj fazi, duže se
zadržava u hromatografskom sistemu od one koja pokazuje veći afinitet prema
mobilnoj fazi. Kao posledica ovoga hromatografski sistem prvo napušta komponenta
sa najmanjim koeficijentom raspodele.
2.2 Adsorpciona hromatografija
Razdvajanje komponenata iz smeše adsorpcionom hromatografijom vrši se
na osnovu sposobnosti stacionarne faze da različito adsorbuje komponente smeše.
Kao stacionarna faza koriste se čvrste supstance – adsorbensi – koje su porozne i
imaju veliku aktivnu površinu, a samim tim i površinsku energiju koju teže da smanje,
tako što privlačnim silama vezuju molekule ili jone iz gasova ili tečnih rastvora.
Pri adsorpciji komponenata iz gasne smeše razlikuju se fizička i hemijska
adsorpcija koje se opisuju Langmuirovom (jednačina 3) i Freundlichovom (jednačina
4) adsorpcionom izotermom.
(3)
(4)
gde je:
P - ravnotežni pritisak gasa,
V – zapremina adsorbovanog gasa,
Vmax – kapacitet adsorbensa (maksimalna zapremina adsorbovanog gasa),
x – broj molova adsorbovanog gasa,
m – masa adsorbensa,
b, k, n – karakteristične konstante koje zavise od prirode adsorbensa, adsorbata i
temperature.
Fizička adsorpcija se zasniva na uspostavljanju elektrostatičkih (dipol-dipol,
van der Waalsovih) i vodoničnih veza između stacionarne faze i komponenti, a pri
hemisorpciji dolazi do stvaranja hemijskih veza usled čega se na površini
adsorbensa obrazuje monomolekulski sloj adsorbata.
7
