Факултет медицинских наука Крагујевац, академске докторске студије
ИП10: Матичне ћелије у биомедицинским наукама
Модул I, недеља VI
Основне морфолошке и функционалне карактеристике индукованих плурипотентних
матичних ћелија. Механизми индукције плурипотентности. Мембрански маркери;
потврђивање фенотипа матичних ћелија; (Surface antigen markers and lineage markers). Значај
индукованих плурипотентних матичних ћелија.
Немања Мурић 15/2016
Индуковане плурипотентне матичне ћелије (скр. ИПС,
енгл. induced pluripotent stem cells
)
настају у лабораторији. У зреле ћелије се посебном методом уводе гени који имају
способност да диференциране ћелије „врате“ у недиференцирано, матично стање. Овако
добијене ћелије су налик ембрионалним и могу се култивацијом у одговарајућим условима
поново диференцирати у жељени ћелијски тип.
Индуковане плурипотентне ћелије су створене од стране присилне експресије неколико
гена. Класични ''микс'' чине протеини и транскрипциони фактори
Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-
Myc
. Они имају способност да репрограмирају соматске ћелије миша, човека, пацова,
мајмуна и пса. Сви ови фактори имају транскрипционе активности тако да Oct3/4, Sox2 и
Klf4 регулишу многе комбинације гена специфичних за ћелију.
ИПС ћелије имају огроман потенцијал за снабдевање пацијент-специфичних
плурипотентих матичних ћелија које су важне за употребу у проучавању патогенезе
болести, открићу лекова, токсикологији, као и за трансплантацију самих ћелија. Велики
број научних студија подржавају закључак да су ИПС ћелије су веома сличне, али не и
идентичне ЕС(ембрионалне ћелије,енгл.
Embrionic stem
) ћелијама. Међутим, нема довољно
Слика 1.
Експресија c-Myc ћелија старења убрзава пролиферацију фибробласта и индукује
унапређење ИПС индукције. c-Myc везује више од 4.000 локација у геному.
Као последица тога могу се олабавити чврсто упаковани хромозома у соматским ћелијама и
повећати доступност осталих фактора транскрипције са геномом током ИПС
индукције. Прекомерна експресија самог c-Myc такође мења експресију гена мишјих
ембрионских фибробласта (скр.енгл. MEFs) ка плурипотентним ћелијама.
LIN28 је RNA-везујући протеин који негативно регулише Let7 mRNА (микро РНК)
породицу. Let7 промовише диференцијацију ћелија карцинома дојке и инхибира њихову
пролиферацију.
Стога, изгледа да Let28 индиректно побољшава ефикасност репрограмирања кроз Let7
породицу. Комбинација додатних фактора које се користе у индукцији могу побољшати
ефикасност и квалитет репрограмирања. Додавање транскрипционих фактора, попут
ESRRB26, UTF127 и SALL428, повећава ефикасност. Сви ови фактори су изражени у ЕС
ћелији и укључени у формирање ЕС налик на транскрипциону мрежу.
Tbx3 значајно побољшава квалитет и компетенцију герминативних линија мишјих ИПС
ћелија. Фактор(и) који су укључени у репрограмирање могу се смањити ако соматске
ћелије имају превише ендогене експресије од стране било ког фактора репрограмирања. На
пример, нервне прекурсор ћелије експримирају ендогене SOX2, KLF4 и c-MYC, а потребни
су им само OCT3/4 трансгени за индукцију ИПС ћелија.
Убрзање ћелијске пролиферације и инхибиција старења сузбијањем p53 и p21 путева може
драматично повећати ефикасност. Пораст броја ћелија под индукциојом резултују великим
бројем формираних ИПС колонија, јер процес репрограмирања укључује стохастичне
догађаје. Сузбијање p53 повећава ефикасност репрограмирања углавном кроз убрзавање
ћелијске деобе. С друге стране, додавање Nanog фактору репрограма повећава нето
ефикасност репрограмирања. Међутим, потискивање p53 и p21 путева повећава геномску
нестабилност ИПС ћелија. Због тога перманентну супресију пута треба избегавати, јер би се
смањио квалитет ИПС ћелија. Прелазно потискивање инхибитора или siRNA може бити
корисно за унапређење репрограмирања.
Индукција ИПС ћелија траје најмање једну недељу код мишева и две недеље код људи. С
друге стране, репрограмирање фузијом ЕС ћелија се споводи веома брзо. Активација
ендогеног Oct3/4 промотера једара соматских ћелија је забележена у року од два дана. Иако
трансгена експресија у ИПС ћелијама захтева неколико дана након вектор трансдукције,
чини се да репрограмирање ИПС ћелија захтева много више времена од ћелијског фузије.
ЕС ћелије морају имати други фактор (е) да
би се
олакшало
репрограмирање. Репрограмирање се дешава природно ин виво у раној фази развоја.
Оплођена јаја бришу скоро цео епигенетски статус осим импринтинг пре формирања
бластоциста , а обнављају га даље како процес диференцијације тече. Јаја такође имају
велику репрограмну активност јер могу произвести клонирану животињу после енуклеације
и фузије са соматским ћелијама.
Иако механизам остаје нејасан, клонирање може да пружи корисне савете за побољшање
генерације ИПС ћелија. Међутим, клонирани мишеви имају неке абнормалности попут
велике плаценте и тенденције да стекну вишак килограма што имплицира да постоје нека
ограничења у вештачком репрограму који се морају узети у обзир.
Трансдукционе методе
ИПС ћелије су првобитно добијене из испоруке гена од стране ММЛВ (енгл. Moloney
murine leukemia virus) ретровиралних вектора. Ретровирус може снажно да инфицира мишје
фибробласте и да уведе своју РНК у геном домаћина путем ензима реверзне
транскриптазе. Стога, ИПС ћелије интегришу бројне трансгене, који тиме омогућавају
сталну експресију трансгена.
Инактивација ретровирусног промотора као последица ДНК метилације је посматрана у ЕС
ћелијама исто као и у ИПС ћелијама. Из тог разлога се експресија ретровирусних трансгена
постепено потискује током процеса репрограма, а утишавање је завршено када ћелије
постају иПС ћелије. Овај аутоматски механизам утишавања је потребан да би обезбедио
ефикасно репрограмирање у соматским ћелијама.
