Hromatografija

UVOD

Pod hromatografijom se danas podrazumeva skup analitičkih metoda

za analizu uzoraka, koji su po svojoj prirodi smeše komponenata, čija

hemijska priroda može biti slična, ali i vrlo različita. Pod analizom ovakvih

uzoraka se do skoro podrazumevalo samo razdvajanje uzorka-smeše na

njene sastavne komponente, ali je uvođenje najsavremenijih tipova

detektora proizišlih iz eksplozivnog razvoja elektronike u zadnje dve-tri

dekade (praćeno još i uvođenjem moćnih software paketa) proširilo osnovno

značenje hromatografije. Dakle, od vremena prvog publikovanog

hromatografskog eksperimenta iz 1906. godine, propuštanja hlorofilnog

rastvora kroz stub kalcijum-karbonata (koji se pripisuje ruskom naučniku

Cvetu), pređen je vrlo dug put, i danas hromatografske metode služe ne

samo za pročišćavanje složenih uzoraka, već i za bar delimičnu analizu

razdvojenih komponenti smeše. Inače, sam naziv hromatografija potiče od

grčkih reči

"chromos" -

boja, i

"graphein" -

pisati, i tiče se samih početaka

hromatografije i pročišćavanja samo obojenih rastvora. Naravno. etimološki,

ovaj naziv je danas potpuno deplasiran, jer se hromatografijom odavno

razdvajaju i bezbojne supstance. Ipak, prvobitni naziv se održao.

Hromatografske metode spadaju u fizičkohemijske metode analize,

poput recimo spektroskopskih metoda (ultravioletne - UV, infracrvene - IR,

masene - MS, nuklearne magnetne rezonance -NMR), ili raznih standardnih

instrumentalnih metoda (polarimetrija. refraktometrija itd). Dakle one

koriste izabranu strukturnu osobinu supstanci, i tokom analize ne menjaju

njihovu hemijsku prirodu. Hromatografijom se mogu analizirati i smeše onih

supstanci, koje se ne mogu rastaviti hemijskim metodama ili raznim drugim

fizičkim metodama. Pri tome se, ukoliko se hromatografski postupak obavlja

korektno, ukupna kolicina uzorka neznatno menja, i ukoliko je to potrebno,

moguća je i kvantitativna kolekcija razdvojenih komponenti (tzv.

preparativna hromatografija). Pri tome je, kod nekih savremenijih

hromatografskih metoda "prag" kvalitativne osetljivosti vrlo nizak, t.j.

moguće je razdvojiti i analizirati vrlo male količine ispitivanih supstanci, u

rangu onih koje detektuje npr. atomska apsorpciona analiza (znaci, oko 10

-8

g, pa i manje).

Danas u literaturi postoji dosta različitih klasifikacija hromatografskih

metoda, i to pre svega zbog različitih kriterijuma na kojima se ove

klasifikacije zasnivaju. To unosi dosta nepotrebne konfuzije, jer se najveci
broj savremenih hromatografskih metoda, uključujući i neke "klasične",
zasniva na tri fizičkohemijska principa: adsorpcije,

raspodele i jonske

izmene, te bi ovaj kriterijum (principa razdvajanja) verovatno bilo
najispravnije koristiti.

Pojmovi u hromatografiji



Analit

je supstanca koja se razdvaja, analizira;



Analitička hromatografija

se koristi za kvalitativno i

kvantitativno određivanje prisustva analita u uzorku.



Preparativna hromatografija

služi za pripremu, prečišćavanje,

analita (ne i za analizu).



Hromatograf

je hromatografski instrument;



Hromatogram

je vizuelni prikaz rezultata heomatografskog

postupka.



Eluent

je komponenta separacionog sistema koji pokreće

uzorak preko stacionarne faze.



Efluent

je kompletna mobilna faza koja prelazi preko

stacionarne faze

[2]

;



Mobilna faza

je pokretna faza. Mobilna faza može biti tečna (LC)

ili gasovita (GC). mobilna faza se sastoji od nosioca analita i analita;



Stacionarna faza

je nepokretna faza preko-kroz koju prolazi

mobilna faza sa analitom i koja ima funkciju razdvajanja analita na sastavne

delove.



Retenciono vreme

je vreme za koje analit prođe kroz

hromatografski sistem pod određenim uslovima (temperatura i pritisak);

Klasifikacija hromatografkoh metoda

Hromatografske metode se dele prema fizičkom stanju faza, prema

fizičko-hemijskim reakcijama koje se dešavaju prilikom razdvajanja

komponenti ili mehanizmu razdvajanja.

Podela prema fizičkom stanju faza



Tečna hromatografija:

Adsorpciona (tečno/čvrsto), TLC, HPLC

Jonska

3- Detekcija zona vrši se najrazličilijim metodama. Obojene zone se

jasno raspoznaju na belo obojenom adsorbensu. Neobojene supstance se

često pretvaraju u obojena jedinjenja prelivanjem kolone odgovarajućim

reagensom. Osim vizuelnog utvrđivanja položaja zona, sve više se

primenjuju fizičko-hemijske metode kao što su: refraktometrija (merenje

indeksa prelamanja), UV sprektroskopija (posebno za razdvajanje i analizu

organskih jedinjenja), polarimetrija (ako su u pitanju optički aktivna

jedinjenja), radiohemijske metode (za analizu radioaktivnih uzoraka).

4. U zavisnosti od toga da li je hromatografija analitička ili

preparativna (skupljanje frakcija), ispiranje zona znači dalje dodavanje

rastvarača ili smeše rastvarača, sve dok se zone pojedinih komponenti (koje

nisu jasno razdvojene) u potpunosti ne razdvoje i omogući njihova uspešna

detekcija, ili, ukoliko je potrebno, i kvantitativno sakupljanje. Može se reći da

je ispiranje produženo razvijanje hromatograma.

Proces ispiranja često se naziva i eluiranjem. Rastvarač ili smeša

rastvarača kojim se vrši eluiranje naziva se eluent, a "isprane" komponente

smeše nazivaju se eluati. Hromatografija u koloni može biti:

a) Tzv. klasična adsorpciona hromatografija (polarna stacionarna faza

i manje više nepolarna mobilna faza).

b) Tzv. adsorpciona hromatografija obrnutih faza (nepolarna

stacionarna faza i uglavnom polarna mobilna faza).

Adsorpcija na adsorbensu vrši se po principu slično - slično, tj.

polarne komponente smeše će se lakše adsorbovati na polarnoj
stacionarnoj fazi od nepolarnih (klasična adsorpciona hromatogiafija) i
obrnuto.

Izbor adsorbensa

. Od adsorbensa se zahteva da poseduju određene

osobine i to:

1. Adsorbens mora biti nerastvoran u svakoj od upotrebljenih mobilnih faza.

2. Adsorbens mora da bude takav da reverzibilno adsorbuje datu supstancu,

pri tom ne izazivajući nikakve hemijske promene na njoj.

3. Adsorbens mora imati dovoljno razuđenu površinu (tj. dovoljno aktivnih

centara) za adsorpciju svih komponenti smeše ali ne sme bili previše aktivan

da spreči kretanje zona pri procesu razvijanja hromatograma. Veličina

(krupnoća) čestica treba da je takva da eluent može kroz njega da prolazi

umerenom brzinom (5-20 cm

min

-1

Adsorbensi mogu biti polarni i nepolarni.

Nepolarni adsorbensi

aktivni ugalj, neke organske smole.

Polarni

adsorbensi

feri-oksid, aluminijum-oksid, silika-gel, kalcijum-oksid,

magnezijum-oksid, magnezijum-karbonat. kalcijum-fosfat, kalcijum-

karbonat, ugljeni hidrati (skrob, šećer, celuloza). Njihova aktivnost opada

onim redom kojim su navedeni.

Polarni adsorbensi

su od naročitog značaja. Njihov afinitet prema

odgovarajućem adsorbatu, razume se raste s polarnošću adsorbata. Stoga

se voda naročito jako adsorbuje i aktivna površina adsorbensa utoliko manje

moze da adsorbuje drugih manje polarnih supstanci ukoliko je više već

pokrivena molekulima vode.

Na jačinu adsorpcije organskih jedinjenja, pored polarnosti, utiče i

veličina molekula i mogućnost polarizovanja.

Afinitet pojedinih klasa jedinjenja prema polarnim adsorbensima

raste sledećim redom: halogenovani ugljovodonici. etri, terc. amini i nitro

jedinjenja, estri, ketoni i aldehidi,

prim.

amini

amidi kiselina, alkoholi,

karbonske kiseline.

Aluminijum-oksid i silika-gel su se pokazali kao vrlo pogodni

adsorbensi za mnoge hromatografske analize.

Poveћanje aktivnosti aluminijum-oksida (glinice), se postiжe

ispiranjem чesmenskom vodom i sušenjem jakim zagrevanjem. Ovaj

postupak unosi u aluminijum-oksid tragove kalcijum-karbonata koji

verovatno utiču na povećanje aktivnosti glinice, pa je bolje da se ispiranje u

ovom slučaju vrsi 5% rastvorom kalcijum-hidroksida umesto česmenskom

vodom. Ovaj adsorbens se uglavnom koristi za razdvajanje obojenih

jedinjenja, uglavnom neorganskih kompleksa.

U sledećoj tabeli dat je pregled adsorbenasa i klasa jedinjenja koje

razdvajaju.

Mehurići vazduha, neujednačeno punjenje i pukotine u stacionarnoj

fazi moraju se izbeći po svaku cenu. Treba voditi računa da kolona ni u

jednom trenutku ne ostane "suva" (bez sloja rastvarača iznad adsorbensa),

jer se u protivnom u sloju adsorbensa stvaraju pukotine. Kroz nehomogeno

napunjenu staklenu cev s odgovarajućim adsorbensom eluent se kreće

neravnomerno i u toku razvijanja

hromatograma stvaraju se zone

nepravilnog oblika.

Količina adsorbensa koja se uzima za pripremanje kolone zavisi od

njegove aktivnosti i količine supstance koja se hromatografiše (obično se
uzima 20-50 g za jedan gram supstance. 30-80 g adsorbensa za dva grama
supstance).

Izbor rastvarača.

Rastvarači koji se upotrebljavaju u

hromatografiji imaju trostruku ulogu:

1. služe za unošenje smeše koja se razdvaja u koloni;

2. izazivaju proces razvijanja hromatograma (razvijači);

3. ispiraju pojedine komponente prvobitne smeše, koncentrisane u

odvojenim zonama.

Odabrani rastvarači moraju da budu hemijski inaktivni u odnosu na

adsorbens i komponente smeše koje se razdvajaju; adsorpcija na površini

adsorbensa treba da je minimalna i sve komponente smeše treba da se u

njima lako rastvaraju.

Svakako da je izbor eluenta tesno vezan kako s prirodom odabranog