EKSPRESIJA GENA I PROTEINA
1.1.
ANALIZA EKSPRESIJE GENA
Ekspresija mnogih gena može biti određena merenjem nivoa informacione RNA
primenom različitih multipleks
in situ
hibridizacija, ili primenom velikog broja metoda kao što
su: mikroesej, sekvencioniranje eksprimirane sekvence cDNA ostatka (EST), serijska analiza
genske ekspresije sekvenciranog ostatka (SAGE), sekvencioniranje masovnim paralelnim
obeležavanjem (MPSS), RNA sekvencioniranje tj. Shotgun sekvencioniranje čitavog
transkriptoma (WTSS) itd. Sve ove tehnike su ekstremno sklone pojavi šumova i/ili su predmet
pristrasnosti u biološkim merenjima. Zato je najveće istraživačko područje u kompjutacionoj
biologiji posvećeno razvijanju statističkih alata za razdvajanje pravih signala od šumova u
istraživanjima visokopropusne ekspresije gena. Takve studije se često koriste za određivanje
gena koji su povezani sa određenim bolestima – tako se mogu porediti podaci iz mikroeseja za
kancerozne epitelne ćelije sa podacima dobijenim iz nekanceroznih ćelija da bi se odredili
transkripti koji imaju up i down regulaciju u određenoj populaciji kanceroznih ćelija.
Serijska analiza genske ekspresije (SAGE)
je transkriptomska tehnika koju su razvili
molekularni biolozi da bi dobili snimak populacije informacione RNA u ispitivanim uzorcima u
obliku malih ostataka koji odgovaraju fragmentima tih transkripata. Razvijeno je nekoliko
varijanti od najjačih LongSAGE, RL-SAGE do najnovije SuperSAGE. Mnoge od ovih su
poboljšale tehniku sa dobijanjem dužih ostataka, omogućavajući pouzdaniju identifikaciju izvora
gena.
Sekvencioniranje masovnim paralelnim obeležavanjem (MPSS)
je postupak koji se
koristi za identifikaciju i kvantifikaciju iRNA transkripata što rezultira u dobijanju podataka
sličnim onima koji se dobijaju primenom SAGE metode, iako ova metoda koristi seriju potpuno
drugačijih koraka u sekvencioniranju i biohemijskim metodama.
DNA mikroesej
(takođe poznat i kao DNA čip ili biočip) je kolekcija mikroskopskih
DNA tačaka koje su prikačene na solidnu površinu. Naučnici koriste DNA mikroeseje da bi
izmerili uporedo nivoe ekspresije velikog broja gena ili da izvrše genotipizaciju multiplih
regiona u genomu. Svaka DNA tačka sadrži pikomole (10
−12
molova
) specifične DNA sekvence,
poznate kao probe. Ovo može biti kratki deo gena ili drugih DNA segmenta koji se koriste za
1
hibridizaciju cDNA ili cRNA (takođe poznata kao antisens RNA) uzoraka, koji se nazivaju
targeti (mete), u visoko specifičnim uslovima. Hibridizacija ciljne probe se obično detektuje i
kvantifikuje putem fluorescentno, silverscentno ili hemiluminiscentno obeleženih meta da bi se
odredila relativna brojnost sekvenci nukleinskih kiselina u odabranoj meti. Originalni esej
nukleinskih kiselina je bio makroesej od oko 9x12 cm i prva kompjuterizovana slika zasnovana
na analizama je objavljena 1981. godine.
U genetici, eksprimirani sekvencioni ostatak (EST) je kratka podsekvenca cDNA
sekvence. ESTovi mogu biti iskorišćeni za identifikaciju transkripta gena, i zapravo su sredstvo u
otkrivanju gena i određivanju genske sekvence. Identifikacija ESTova se brzo nastavila, sa
prosečno 74.2 miliona ESTova koji su danas javno dostupni u bazama podatka (e.g. GenBank
1.01.2013. za sve vrste).
EST nastaje od jednokratnog sekvencioniranja klonirane cDNA. cDNA iskorišćene za
stvaranje ESTova su obično pojedinačni klonovi iz cDNA biblioteke. Dobijena sekvenca je
relativno niskokvalitetni fragment čija je dužina ograničena trenutno dostupnom tehnologijom na
prosečno 500 do 800 nukleotida. Zato što su ovi klonovi sastavljeni od DNA koja je
komplementarna iRNA, ESTovi predstavljaju delove eksprimiranih gena. Oni mogu biti
predstavljeni u bazama podataka i kao cDNA/iRNA sekvence ili kao reverzni komplement
iRNA, lanca koji služi kao kalup. Moguće je mapirati ESTove na specifičnim hromozomskim
lokacijama korišćenjem tehnika fizičkog mapiranja kao što je radiaciono hibridno mapiranje,
Happy mapiranje ili FISH. S druge strane, ako genom organizma iz koga potiče EST jeste
sekvencioniran, moguće je poravnati EST sekvencu sa tim genomom korišćenjem kompjutera.
Na osnovu trenutnog poznavanja humanog genoma (od 2006.godine) znamo da postoje
hiljade gena i to samo na osnovu ESTa kao dokaza. U tom smislu, ESTovi su postali sredstvo za
fino predviđanje transkripata ovih gena, što dovodi do predviđanja njihovih proteinskih
produkata i konačno njihove funkcije. Štaviše, situacija u kojoj su ovi ESTovi dobijeni (tkivo,
organ, zdravstveno stanje – e.g. kancer) daje informacije o stanju u kome određeni gen ima
funkciju. ESTovi sadrže dovoljno informacija da dozvole dizajniranje preciznih proba za DNA
mikroeseje koji onda mogu biti iskorišćeni za određivanje genske ekspresije. Neki autori koriste
termin “EST” da opišu gene za koje postoji malo ili nimalo dodatnih informacija osim oznake.
2
