Univerzitet u Beogradu
Hemijski fakultet
Seminarski rad iz predmeta patobiohemija:
Laboratorijsko određivanje proteina
Autori: Predmetni nastavnik:
dr Marija Gavrović Jankulović
2016.godina
Proteini
Proteini su polimeri koji se sastoje od kovalentno povezanih aminokiselina. Oni imaju
veliki broj uloga u ljudskom organizmu: gradivna (primarna funkcija), kontraktilna (aktin,
miozin), katalitička (enzimi), regulatorna (receptori, hormoni, inhibitori), transportna
(hemoglobin, albumin, transferin, apolipoproteni, tiroksin-vezujući globulin), imunološka
(imunoglobulini i komplement) i dr.
Organizam čoveka je izgrađen od mnoštva različitih proteina, od kojih veliki broj čine
strukturne komponente ćelija i tkiva, dok su ostali rastvoreni u intracelularnim i ekstracelularnim
tkivima. Proteini koji se rutinski analiziraju u laboratoriji potiču iz krvi, urina, cerebrospinalne
tečnosti, pljuvačke, fecesa, peritonealne ili pleuralne tečnosti. Kada je reč o dijagnostici
najvažniji su proteini krvne plazme. U tabeli 1. su navedene karakteristike plazma proteina.
Tabela 1. Karakteristike plazma proteina.
varijacije u količini i sastavu proteina od uzorka do uzorka. Prisustvo proteina u urinu
(proteinurija) se javlja usled:
- povećanog glomerularnog permeabiliteta (glomerularna proteinurija), posledica nefrotskog
sindroma;
- defektne tubularne reapsorpcije (tubularna proteinurija);
- prekomernog izlučivanja putem urina patoloških, niskomolekulskih proteina, koji su povećani u
plazmi (proteinurija usled preopterećenja);
- produkcija proteina u postrenalnom traktu (postrenalna prteinurija), javlja se usled inflamacije i
malignih stanja.
Metode za određivanje koncentracije ukupnih proteina su:
Kjeldal-ova metoda
Najstarija način za određivanje proteina je Kjeldal-ova metoda u kojoj se dejstvom
kiselina oslobađa azot u vidu NH
4
+
jona i u baznoj sredini prevodi u NH
3
. NH
3
se dalje određuje
titracijom ili neslerizacijom (reakcija sa kalijum tetrajodomerkuratom(II) ). Ovde je neophodno
izvršiti korekciju za azot prisutan u neproteinskim komponentama. Metoda je dobro definisana,
reproducibilna, tačna i precizna, ali je zametna i nije praktična za rutinske analize. Ona se obično
koristi kao referentna metoda.
Biuret-ska metoda
Najčešće korišćena metoda u rutinskim laboratorijama. Biuretska reakcija može da se
koristi i za kvalitativnu i za kvantitativnu analizu proteina. Ona zavisi od prisustva peptidne veze
u proteinima. Kada se rastvor peptida ili proteina tretira sa jonima bakra u alkalnoj sredini,
stvara se obojeni helat između Cu
2+
i kiseonika karbonil grupe (CO) i azota iz amidske grupe
(=NH) peptidne veze. Kompleks je ljubičasto-plave boje, koji se spektrofotometrijski meri na
550 nm (Slika 1). Slična reakcija se ostvaruje i između Cu
2+
i organske komponente biureta, pa je
metoda dobila ime po ovoj reakciji. Reakcija se ostvaruje ukoliko jedinjenje ima bar dve
peptidne veze. Jedan Cu(II) jon se vezuje koordinativnim vezama sa šest susednih peptidnih
veza. Amino kiseline (nemaju peptidnu vezu) i dipeptidi (imaju samo jednu peptidnu vezu) ne
reaguju, ali tri-, oligo- i polipeptidi reaguju i daju od purpurne do tamno ljubičaste boje. Intezitet
boje je proporcionalan broju peptidnih veza koje reaguju, a samim tim i broju molekula proteina
u reakcionom sistemu.
Slika 1. Biuretska reakcija.
Metoda je jednostavna, može da se primeni na automatima i dovoljno je precizna za kliničku
upoterbu. Nivo proteina u plazmi, zbog prisustva fibrinogena je viši za 2-4g/L u odnosu na
serum. Kao standardi mogu da se koriste humani serum albumin i goveđi serum albumin. Pošto
humani serum albumin ima nižu reakcionu brzinu sa biuretskim reagensom od goveđeg, tehnike
koje mere inicijalnu brzinu moraju biti standardizovane humanim albuminom. Zbog toga što je
jeftiniji češće je u upotrebi goveđi serumski albumin.
Metoda po
Lowry-u
Zasniva se na pretretmanu uzorka alkalnim rastvorom bakra, a zatim na dodatku Folin i
Ciocalteu fenolnog reagensa. Plavo obojeni kompleks nastaje redukcijom fosfovolframove i
fosfomolibdenske kiseline pod dejstvom kompleksa bakar-peptidna veza iz tirozina i triptofana
proteina. Cistin, cistein i histidin su takođe reaktivni u ovim uslovima, ali u manjoj meri.
Koncentracija se određuje spektrofotometrijski. Osetljivija je oko 100 puta više u odnosu na
biuretsku metodu, ali se ne koristi u rutinskim laboratorijama. Karakteriše je slaba specifičnost i
brojne interferencije. Pošto sastav tirozina varira od proteina do proteina i intezitet boje će biti
drugačiji za različite proteine. Takođe ovaj postupak je spoj dve metode, a oba reagensa su
nestabilna i sa kratkim rokom upotrebe.
Direktnan fotometrijski metod
