Fizičke osobine virusa
•
Po obliku, građi i sastavu virusi ispoljavaju karakteristične fizičke
osobine koje omogućavaju njihovo bliže poznavanje i definisanje. Za
određivanje fizičkih osobina virusa primenjuju se razne metode koje se za
odgovarajuća ispitivanja koriste u oblasti fizike.
•
Od fizičkih osobina virusa u ovom izlaganju razmotrićemo
hidrodinamičke, elektroforetske, biofizičke i optičke osobine.
Hidrodinamičke osobine
Ove osobine se zasnivaju na sposobnosti kretanja virusnih čestica u tečnoj
sredini. Virusne čestice grade suspenziju u tečnoj sredini .
Dinamičke osobine u takvoj suspenziji su određene i zavise od vrste virusa,
osobine dispergenta i spoljnih uslova.
Jedna od značajnih hidrodinamičkih osobina je sedimentacija (taloženje)
virusnih čestica u dispergentu.
Sedimentacija se karakteriše određenom brzinom i sedimentacionom
konstantom.
Brzina sedimentacije virusnih čestica zavisi od njihovog broja i oblika,
zatim od sastava dispergenta i zemljine teže-gravitacije. Čestice biljih
virusa su, međutim, lake (molekulska težina od 10
6
do 10
8
daltona), pa se
njihovo taloženje ne može obaviti dovoljno brzo pod dejstvom zemljine
teže.
Zato se virusne suspenzije izlažu centrifugiranju, pri čemu se dejstvo
zemljine teže uvećava za oko 10
3
do 3x10
5
(1000 do 300 000 puta). U toku
centrifugiranja virusne čestice se pasivno kreću centrifugalno.
Brzina pomeranja se izračunava na jedinicu centrifugalnog polja i izražava
koeficijentom sedimentacije. Pošto koeficijent zavisi od vrste dispergenta,
okolne temperature i koncentracije virusa mora se korigovati na
sedimentaciju u vodi temperature 20
o
C ili 25
o
C.
Ovako korigovan koeficijent predstavlja
sedimentacionu konstantu
(S20w)
virusa, koja predstavlja ultracentrifugijsku jedinicu i izražava se kao
jedinica po Svedbergu (1S=10
-13
sec).
A
Svedberg
(symbol
S
, sometimes
Sv
) is a non-
SI
physical
unit used in
1
ultracentrifugation
. It is named after the
Swedish
physicist
and
chemist
Theodor Svedberg
(
1884
-
1971
), winner of the
Nobel prize
in
chemistry
in
1926
for his work in the chemistry of
colloids
and his invention of the
ultracentrifuge
.
The sedimentation rate or coefficient of a particle or
macromolecule
is
computed through dividing the constant
speed
of sedimentation (in
ms
−
1
)
by the
acceleration
applied (in
ms
−2
). The speed is constant because the
acceleration applied by the ultracentrifuge (measuring typically in the
millions of
gravities
) is cancelled by the viscous resistance of the medium
(normally
water
) through which the particle is moving. The result has the
dimensions
of a unit of
time
and is expressed in svedbergs. One svedberg is
defined as exactly 10−13
s
.
The svedberg is not additive: a particle formed of two 5 S particles will not
have a sedimentation coefficient of 10 S.
Sedimentaciona konstanta je specifična za vrstu virusa i koristi se kao
jedna od odlika za njegovu determinaciju.
Merenjem brzine sedimentacije mogu se ocenjivati i druge osobine virusa
kao što su molekulska građa i molekulska težina.
Ako se, naprimer, u jednoj virusnoj suspenziji nađu čestice koje se
razlikuju samo u količini nukleinske kiseline, one će prema ovoj količini
imati različite sedimentacione konstante.
Sedimentaciona konstanta, prema tome, pokazuje razliku u njihovoj
molekulskoj građi. Sedimentacionom konstantom su kod nekih
izometrijskih virusa izdvojene infektivne od neinfektivnih čestica, koje su
inače po morfološkim, serološkim i proteinskim osobinama slične.
Elektroforetske osobine
Elektroforeza je kretanje naelektrisanih čestica pod utcajem električnog
polja. Zahvaljujući omotaču virusne čestice su naelektrisane i odlikuju se
elektroforetskim osobinama. Naelektrisanost virusnih čestica izazivaju
jonizovane karboksilne COOH i amino NH
2
grupe aminokiselina koje
učestvuju u građi kapsida. Elektroforetski su aktivne samo one jonizovane
grupe koje se nalaze na površini kapsida.
Naelektrisanost delova virusnih čestica, koja se nalazi u njihovom
unutrašnjem delu, ne utiče na elektroforetsku pokretljivost.
2
Elektroforetska pokretljivost čestica omogućuje različita proučavanja
virusa. Pošto je pod određenim uslovima stalna može da posluži za
izdvajanje i determinaciju vrste virusa kod mešovite zaraze.
Po elektroforetskoj aktivnosti mogu se razlikovati pojedini sojevi virusa
kao što je to slučaj kod virusa mozaika duvana. Trojake čestice virusa
šarenila boranije, koje imaju različite sedimentacione konstante pokazale
su se i elektroforetski različito.
Izdvajanjem virusa na ovaj način od drugih sastojaka u suspenziji može se
postići prečišćavanje virusa, što je od posebnog značaja za viruse čije su
čestice različite veličine i gustine, ali koje imaju istu proteinsku građu, što
znači i istu elektroforetsku pokretljivost.
Po određenom postupku (u poliakridamidu razne gustine) mogu se,
pomoću elektroforeze, otkriti čestice različitih veličina, kao što je slučaj kod
virusa enacijskog mozaika graška.
Veliki značaj elektroforeze u virusologiji je u tome što omogućuje
pripremanje homogenih prečišćenih virusnih suspenzija.
Optičke osobine
Virusne čestice i njeni delovi odlikuju se određenim optičkim osobinama,
što omogućava njihovo razlikovanje i posmatranje u tečnosti u kojoj grade
suspenziju.
Rasipanje svetlosti
•
Virusne čestice, slično drugim česticama, izazivaju u suspenziji
rasipanje (rasejavanje) obične svetlosti. Rasipanje se ispoljava mućenjem ili
opaloscencijom virusne suspenzije.
•
Na stepen rasipanja svetlosti utiče koncentracija virusa, veličina
njegovih čestica i talasna dužine svetlosti. Rasipanje svetlosti je naročito
izraženo kada su virusne čestice za 10% duže od talasne dužine svetlosti.
•
Merenjem rasipanja svetlosti pri različitim uslovima njegovog
prodiranja može se oceniti molekulska težina virusnih čestica nezavisno od
njihovog oblika, veličine i konfiguracije.
Prelamanje svetlosti
•
Virusne čestice prelamaju svetlost jače od tečnosti u kojoj su
dispergovane (sa kojom čine suspenziju).
•
Specifično povećanje u prelamanju svetlosti predstavlja razliku u
prelamanju čiste tečnosti i 1% suspenzije virusa.
4
•
Merenjem prelamanja svetlosti pomoću osetljivih refraktometara
može se odrediti masa virusnih čestica. Ako se u građi virusne čestice
nalaze lipidi onda je potrebno korigovati podatke o njihovoj masi.
Absorpcija ultraljubičaste svetlosti
•
Absorpcija (upijanje) UV svetlosti je jedna od optičkih osobina virusa
koja se redovno primenjuje u ispitivanju biljnih virusa.
•
Biljni virusi sadrže dve supstance koje vrše apsorpciju UV svetlosti:
nukleinske kiseline sa purinskim i pirimidinskim bazama i proteine. U
slučaju proteina naročito su značajni aromatične kiselina u njihovom
sastavu, koje imaju visoku moć upijanja.
•
Nukleinske kiseline i proteini absorbuju UV zrake čije su talasne
dužine od 220-300 nm. Merenjem optičke gustine virusne suspenzije na
pomenutim talasnim dužinama može se odrediti koncentracija virusa, a
takođe i količina i građa nukleinske kiseline.
Stepen absorpcije virusnih čestica u suspenziji uslovljen je, prvenstveno,
sadržajem njihovih nukleinskih kiselina, jer je njihova absorpciona moć
veća za 20 i više puta od proteina pri ultraljubičastoj svetlosti čija je talasna
dužina oko 260 nm.
Koeficijent ekstincije (E
0,1%, 1 cm
) (naziva se i koeficijent absorpcije, označava
sa A) predstavlja optičku gustinu sloja virusne suspenzije od 1 cm,
koncentracije 1mg/ml na talasnoj dužini od 260 nm.
Koeficijent ekstinkcije je konstantan i karakterističan za pojedini virus.
Koeficijent (ekstinkcije) izduženih virusa je znatno niži (od 2,4 do 3,3) od
izometrijskih virusa (od 5 do 13).
Razlog tome je što izometrijski virusi sadrže znatno više nukleinske
kiseline (5-45%) nego anizometrijski virusi (svega oko 5%).
Ukoliko se zna koeficijent absorpcije nekog virusa može se izračunati
apsolutna koncentracija virusa u rastvoru. Pošto je količina apsorpcije
uslovljena pojedinim delovima virusa, ovaj koeficijent govori o hemijskom
sastavu virusa.
Ako se ispituje čista virusna suspenzija na spektrofotometru da bi se videlo
kako će absorbovati UV svetlost od 220-300 nm, onda će se uvek, za svaki
virus dobiti absorpcijska kriva koja će imati vrh kod 260 nm (pik-
maksimalna absorpcija), a udubljenje (dno) kod 240 nm (minimalna
absorpcija).
Merenjem optičke gustine suspenzije jednog virusa na svetlosti raznih
talasnih dužina na spektrofotometru dobija se njegov spektar absorpcije.
Proteini i nukleinske kiseline se međusobno razlikuju po položaju u ovom
5
elektrona se oslobađa iz užarene tanke žice i kreće se ubrzanjem naponske
razlike od 50-100 kilovata. Snop se šalje u žižu sistemom magnetnih sočiva
projektujući posmatrani uzorak na fluorescentski ekran ili fotografsku
ploču. Elektroni koji se kreću imaju veoma kratku talasnu dužinu od oko
0,04 A, što praktično omogućava razdvajanje bioloških predmeta na
međusobnom rastojanju od 15 A ili 1,5 nm.
Elektronska mikroskopija, iako vrlo moćno oružje u rukama istraživača,
ima svojih nedostataka.
Najveći nedostatak je što se na elektronskom mikroskopu ne mogu
posmatrati uzorci u živom stanju.
Drugi nedostatak je nedovoljno postizanje kontrasta na slici između
različitih delova u posmatranom biološkom materijalu. Dok je prvi
nedostatak ostao neotklonjen, drugi se sve uspešnije rešava primenom
novih, podesnijih metoda za snimanje.
Na elektronskom mikroskopu se ne mogu posmatrati živi uzorci, pošto se
koristi vakum u kojoj voda ispari.
Osim toga ovi uzorci moraju biti tanki, jer obično elektroni ne mogu da
prolaze kroz biološke predmete koji su deblji od 200 nm.
Uzorak koji se posmatra na elektronskom mikroskopu stavlja se na nosač
koji obično ima oblik male metalne mrežice prečnika 3 mm; ta mrežica je
prekrivena slojem ugljenika ili ugljenikom presvučene nitroceluloze.
Nakon stavljanja preparata mrežica se stavlja u vakumsku cev mikroskopa.
Pošto različite biološke komponente u preparatu približno jednako
propuštaju elektrone, ne dobija se dovoljno velik kontrast pomoću kojeg bi
se razlikovale određene komponente u uzorku.
Zbog toga je kontrast potrebno pojačati a to se postiže na dva načina:
Senčenje preparata metalnim parama: osušeni uzorak na mrežici izlaže se
parama teških metala kao što su zlato, iridijum, paladijum, platina i dr. Na
taj način čestice metala se nanose samo sa jedne strane struktura koje žele
da se posmatraju. Ako se kroz ovaj uzorak propuste snopovi elektrona,
dobiće se kontrasna slika čestice virusa. Naime, tamo gde je na preparatu
metal elektroni ne prolaze, a gde nema metala prolaze; tako se dobija slika
čestica koje su osenčene a to bitno doprinosi kontrastu slike.
7
