УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ
ПРИРОДНО-МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
ИНСТИТУТ ЗА БИОЛОГИЈУ И ЕКОЛОГИЈУ
ЗАВРШНИ РАД
ПРООКСИДАЦИОНИ ЕФЕКТИ АСПАРТАМА
У КРВИ ПАЦОВА
МЕНТОР КАНДИДАТ
Проф. др Бранка Огњановић Марко Прокић 1043/10
КРАГУЈЕВАЦ
2012.
Прооксидациони ефекти аспартама
Садржај:
I Увод
........................................................................................................................................... 3
1.1. Аспартам .......................................................................................................................... 3
1.1.1.Физичко-хемијске карактеристике аспартама ..................................................................
4
1.1.2 Метаболизам аспартама ……………...........……………………………………...............
4
1.1.2.1. Mетанол ….………………………………………………………………………….
6
1.1.2.2. Фенилаланин .......……………………..……………… ………………….………...
8
1.1.2.3. Аспартат …..……………………………………………………………………….
10
1.2. Глукоза ………………………………………………………………....……………... 10
1.2.1. Гликолиза ………...……………………………………...……………………………...
12
1.2.2. Кребсов циклус трикарбонских киселина ……………………..…………….....……..
12
1.2.3. Пут пентозо фосфата- пут директне оксидације глукозе ..…………...……...……....
13
1.2.4. Метаболизам глукозе у еритроцитима ………………………………………...….......
14
1.3. Оксидациони стрес и Слободни радикали ………………………………....………. 15
1.3.1. Реактивне врсте кисеоника (ROS) ………………………………………….…….........
16
1.3.1.1. Супероксид анјон радикал (О
2
.-
) ……………………………………........…….
18
1.3.1.2. Водоник пероксид (H
2
О
2
) …………………………………………....................
19
1.3.2. Реактивне врсте азота (RNS) и азот-моноксид (NО
.
) ….…………………...………..
20
1.3.3. Липидна пероксидација (LPO) …………….………………………………...………..
25
1.3.4. Антиоксидациони заштитни систем (AOS) ……….……………………...………….
26
1.3.4.1. Супероксид дисмутаза (CuZnSOD) ………………………………..........……...
27
1.3.4.2. Kаталаза (CАТ) …………………………………..................................………....
29
1.3.4.3. Глутатион (GSH) …………………………………………………..........……….
30
1.4. Еритроцити (RBC-Red Blood Cell) …………………………………………….......... 31
1.4.1. Оксидациони стрес у RBC ……….………………………………………………...…..
32
II Циљ истраживања ………………………….....……………………………………..
34
III Материјал и методе …………………………………………………………….......
36
3.1. Материјал ………………………………………………………………………........... 36
3.2. Експериментални модел ………………………………………………………........... 36
3.3. Узимање крви и екстракција ………………………………………………….....…... 37
3.4. Аналитичке методе ……………………………………………………………...….... 37
3.4.1. Одређивање концентрација ROS и RNS ………………………………………….........
37
3.4.1.1. Одређивање концентрације супероксид анјон радикала (О
2
.-
) ..…..................
38
3.4.1.2. Одређивање концентрација водоник пероксида (H
2
О
2
) …………...................
38
3.4.1.3. Одређивање концентрације нитрита (NO
2
-
) …………………………..............
39
3.4.1.4. Одређивање концентрације 3-нитротирозина (3-NТ).......................................
39
3.4.2. Одређивање концетрација липидних пероксида (LPO).................................................
40
3.4.3. Одређивање компоненти АОS у лизату еритроцита......................................................
40
3.4.3.1. Одређивање концентрације редукованог глутатиона (GSH)...............................
40
1
Прооксидациони ефекти аспартама
I Увод
Људи хиљадама година имају жељу за храном слатког укуса. Још цртежи из пећине
Арана у Шпанији показују неолитског човека који је узимао мед из пчелињих кошница,
као и воће које је праисторијски човек користио. Претпоставља се да је сладак укус био
знак прaисторијском човеку да храна није отровна и да може да се једе. Постоје чак и
претпоставке да је жеља за слатким укусом наследна људска особина. Нажалост, највећи
број такве хране садржи и велике количине калорија и угљених хидрата (
Krapp
и сар.,
1998).
Као алтернативна замена за природне шећере развијени су вештачки заслађивачи,
који пружају храни сладак укус са мало, или без калорија. Током последњих неколико
деценија, ниско-калорични вештачки заслађивачи, као што су аспартам, сахарин,
ацесулфам К и сукроза, све више замењују сахарозу и постају широко заступљени у
многим производима у Европи и Северној Америци (
Pinheiro
и сар., 2005). Основна идеја
и разлог за њихову употребу јесте алармантно повећање процената људи који су суочени
са проблемом прекомерне тежине и болестима везаних за њу. Болести које се директно
или индиректно повезују са прекомерном тежином су дијабетес, хипертензија,
хиперлипидемија, хиперхолестеролемија и каридиовасклуларне болести (
Duffy
и сар.,
2004).
1.1. Аспартам
Аспартам је један од најчешће коришћених вештачких заслађивача у
комерцијалним производима, присутан је у преко 6 000 различитих производа. Откривен
је сасвим случајно. Открио га је хемичар Џејмс Шатлер који је радио за G. D. Searle and
Co
.
1965. године. Шатлер је радио на леку за чир на желудцу када је случајно полио по
руци супстанцу за коју се касније испоставило да је аспартам. Знајући да није токсична
одлучио је да је проба и уочио њен изразито сладак укус. Ово сазнање у компанији је
довело до производње на стотине различитих модификација Шалтеровог аспартама а све у
циљу побољшања квалитета и интезитета истог (
Krapp
и сар., 1998).
3
Прооксидациони ефекти аспартама
1.1.1. Физичко-хемијске карактеристике аспартама
Аспартам је дипептид који се састоји од две аминокиселине, L-аргинина и метал
естра
L-фенилаланина. Хемијска структура аспартама је
N-L-α-аспартил-L-
фенилаланин-1-метил естар (сл.1.). Стандардима EU аспартам у производима носи ознаку
Е 951. По интезитету укуса слађи је од сахарозе 180 до 200 пута, а његовом употребом се
спорије развија осећај слатког али зато укус
дуже траје (има већу презистенцију од
сахарозе). Енергетска вредност му је 4 kcal/g.
Аспартам је бели, кристални прах, без
мириса, који је растворљив у води.
Растврољивост зависи од pH и температуре,
Сл.1. Хемијска структура аспартама
максимална растворљивост се постиже при pH
(http://en.wikipedia.org/wiki/File:Aspartame.svg)
2.2 на температури 25°C а минимална на pH 5.2
при истој температури. У сувом стању је стабилан на температури и до 105°C, док је у
раствору стабилан на температурама у опсегу од 30 до 80°C. На вишим температурама
аспартам прелази у дикетопиперазин који је његов деградациони продукт. Због тога се
аспартам не користи у производима који се термички обрађују (
Nabors
и сар., 2001).
1.1.2. Метаболизам аспартама
Аспартам је стабилан при ниској pH вредности тако да желудачни сок пролази
неизмењен. Он се метаболише тек у интестиналном тракту и то на три компоненте:
аспартат, фенилаланин и метанол (сл.2.). Постоје два основна пута метаболизма
аспартама. Он може бити хидролизован у лумену црева на компоненте које се даље
апсорбују у цревне ресице и даље у системску циркулацију. Истовремено са апсорбцијом
метанол се још у лумену црева под дејством химотрипсина хидролизује, док се
аспартилфенилаланин дипептид тек у мукозним ћелијама црева под дејством пептид
хидролаза (аминопептидаза А) метаболише до аспатата и фенилаланина, одакле се даље
апсорбују у системску циркулацију. Други метаболички пут подразумева директно
апсорбцију аспартама у неизмењеном облику у мукозне ћелије црева где даље подлеже
процесима хидролизе на поменуте компоненте. Екстремни услови као што је висока
4
Прооксидациони ефекти аспартама
1.1.2.1. Mетанол
Метанол или метил алкохол (CH
3
OH) је први члан хомологог низа засићених
монохидроксилних алкохола. То је најпростији алкохол. Метанол је релативно слабо
токсичан за организам. Међутим матаболити метанола показују јаку токсичност.
Метаболизам метанола се одвија у јетри, где доспева преко системске циркулације.
Алкохолне дехидрогеназе прве реагују на метанол оксидујући га до формалдехида.
Формалдехид се даље оксидује до мравље (формичке) киселине дејством формалдехид
дехидрогеназе (сл.3.). Превођење формалдехида у мрављу киселину је јако брзо.
Метаболизам мравље киселине зависи од времена које је потребно да се тетрахидрофолат
преведе у форму 10-формил тетрахидрофолат који даље даје угљендиоксид и воду.
Просечан полуживот мравље киселине код људи је 20h. За разлику од њих, код пацова је
полуживот скоро двоструко краћи, а то се објашњава чињеницом да је количина хепатичке
10-формил тетрахидрофолат дехидрогеназе двоструко већа код пацова. 10-формил
тетрахидрофолат дехидрогеназа има кључну улогу у катализовању последњих корака у
оксидацији мравље киселине до нетоксичних продуката (
Barceloux
и сар., 2002).
Сл.3. Метаболизам метанола
(http://www.ebmedicine.net)
Nicholls
је доказао да мравља киселина инхибира активност цитохром C оксидазе у
митохондријама, у субмитохондијским честицама и изолаваном цитохрому аа
3
. Мравља
киселина се везује за шесту позицију у фери хем јону цитохорм оксидазе и на тај начин
спречава оксидативни метаболизам.
Инхибиција цитохром оксидаза комплекса на терминалном крају респираторног
ланца у митохондријама доводи до хистотоксичне хипоксије (представља стање у којем
ћелије не могу да примају кисеоник и ако је нормално допремање кисеоника до њих).
Хистотоксична хипоксија подразумева смањену продукцију ATP у митохондирјама услед
смањене количине кисеоника у ћелијама. Инхибиција цитохром оксидазе мрављом
6
