X hromozom je invertovan tako da formira specifičan oblik – tzv. “Basc” hromozom Inverzija
sprečava da nasledne promene nastale tretmanom mužjaka budu inkorporirane u X hromozom
koji potiče od ženki. Tako se sigurno X hromozom (bez promena u krosing overu) koji je
izmenjen dejstvom mutagena prenosi na muško potomstvo.

2.2 Rastvaranje test supstance

U vodi ili organskom rastvaraču DMSO, aceton, etil-alkohol ili sirćetna kiselina Najčešće

se koristi DMSO koji u krajnjoj koncentraciji treba biti ne više od 0.4%! U starijim izvorima piše
da je gornja granica koncentracije DMSO-a u test podlozi 2% što se u poslednje vreme pokazalo
kao netačno.

2.3 Hranjenje adulta test supstancom

Mužjaci se prebacuju u teglicama na čijem se dnu stavi filter papir natopljen test

supstancom sa dodatkom 1% rastvora saharoze da bi se hranili narednih 24h. Za duže tretmane
filter papir se menja na svaka 24h. Bitno je odrediti LC50 za test supstancu da bi se znalo sa
kojom koncentracijom treba krenuti u testiranje na genotoksičnost. Preporučljivo je koristiti ½
LC50 i ¼ LC50 U slučaju da ispitivana supstanca nema toksičan efekat na jedinke onda se koristi
5% rastvor test supstance. Svaki od tretiranhi mužjaka “divljeg tipa” prebacuje se u flakone sa
hranljivom podlogom zajedno sa tri nove neoplođene ženke “Basc” linije. Nakon dva-tri dana se
mužjaci prebacuju u novu teglicu sa novim ženkama i postupak se ponavlja.  Na taj način se
formiraju tri legla.
Ženke se uvek ostavljaju još 5 dana da bi položile jaja a zatim se i one odstranjuju sa podloge.
Poznato  je  da  nisu  svi  stadijumi  spermatogeneze  podjednako  osetljivi  na  dejstvo  genotoksičnih
supstanci.
Formiranjem  tri  različita  legla  tretiranih  mužjaka  postiže  se  dobijanje  gupa  potomaka  koje  se
međusobno razlikuju po tome na kom je stadijumu spermatogeneze bila germinativna ćelija pri
tretmanu test supstancom, od koje je nastao spermatozoid koji je učestvovao u formiranju zigota.
Nakon izleganja F1 generacije, uzimaju se po deset parova i prebacuju se na svež supstrat da se
spare i polože jaja.

Dva dana nakon početka izleganja F2 generacije pristupa se brojanju na osnvu fenotipa
Bitno je postaviti pozitivnu kontrolu sa poznatim mutagenom (npr 3mM MMS) i negativnu koja
bi predstavljala sam rastvarač da bi poređenje moglo adekvatno da se izvrši. Vrednosti dobijene
za test supstancu se nalaze u granicama vrednosti za negativnu i pozitivnu kontrolu Ako u
flakonu ima 20 ili više potomaka i među njima nema mužjaka “wild type” fenotipa za tu kulturu

se smatra da sadrži letalnu mutaciju i dalja testiranja nisu potrebna. Ako se u teglici izleglo manje
od 20 jedinki a od toga je jedan mužjak “wild type” , onda je neophodno retestiranje ukršzanjem
tri ženke heterozigotne tretirani hromozom i Basc X hromozom sa mužjacima koji imaju Basc
hromozom. U F3 generaciji se ponovo traže mužjaci “wild type”.

Nakon prebrojavanja jedinki konstatuje se:

– Da li su prisutni mužjaci “wild type” fenotipa
– Koliko ima ostalih jedinki
– Odnos mužjaka i ženki u kulturi

Kada se konačno rezultati prikupe onda se frekvenca polno vezanih recesivnih letala izračunava
na sledeći način:

Broj letala/broj letala + broj neletala = % letala

Test j pozitivan ako se u leglima koja su nastala ukrštanjem tretiranih jedinki test supstancom
rezultat značajno razlikuje od rezultata u negativnoj kontroli i obrnuto.
( Zimonjić B. D., Savković N., Anđelković M., 1990 : Genotoksiloški agensi – efekti, principi i
metodologija detekcije. Naučna knjiga . Beograd ).

Drosophila melanogaster

kao model organizma

Vinska mušica

(

lat.

Drosophila melanogaster

) je insekt iz reda

dvokrilaca

.Postoji mnogo

drugih vrsta voćnih mušica, ali vinska mušica daleko je najpoznatija, jer se često koristi za
laboratorijske eksperimente. . Jedan od razloga za to je brz

rast

razmnožavanje

. Vreme jedne

generacije je oko 14 dana u laboratorijskim uslovima (vreme jedne generacije čoveka je oko 20
godina). Svaka

ženka

može proizvesti nekoliko stotina

potomaka

. Još jedna prednost uzgoja je

lako razlikovanje mužjaka i ženki. Naime,

mužjak

ima crnu tačku na leđima, a ženka ima jače

razvijen stomak. Ima osam hromozoma (2n).

Vinska mušica duga je 3 do 4 mm. Hrani se uglavnom živim ćelijama kvasca uglavnom iz
truljenja voća i povrća. U samo dve nedelje , odvija se proces razvoja jajašca u larve, larve u
lutku, iz koje se razvije odrasla jedinka.

5. Materijali i metode

Biljke

Cotinus coggygria

su sakupljene na lokalitetu Rujište u Severnom delu Kosova u

period maj-jun 2007 godine. Vrsta je identifikovana i deponovana na katedri za Botaniku, na
biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu.

Hemikalije

Ukupna količina rastvorljivih fenolnih jedinjenja u metanolu ekstrakta stabla biljke

Cotinus coggygria

određena su uz pomoć FC reagensa koristeći pirokatehol kao standarni

parametar. Ekstrakt metanola je razblažen do koncentracije 0,02 g/ml. Od razblaženog ekstrakta
0,5 ml je pomešano sa 2,5ml FC reagensom i sa 2 ml 7,5 % natrijumhidrogen karbonatom. Posle
15 minuta mešanja na temperaturi od 45 stepeni celzijusa meri se absorpcija na talasnoj dužini od
765 nm na spektrofotometru. Koncentracija ukupne količine fenola iz stable biljke

Cotinus

coggygria

je određena kao milligram pirokatehola ekvivalentno gramu suve mase ekstrakta

koristeći jednačinu dobijenu iz standarnog pirokatehol koeficijenta. Svi uzorci su analizirani u tri
kopija.
Flavonoidna frakcija je nataložena mešanjem 10 ml ekstrakta rastvorenog u metanolu (0,02 g/ml)
sa 10 ml HCl u odnosu (1:3) i 5 mL HCHO (8mg/ml). Posle 24 časa smeša je filtrirana kroz filter
papir. Neflavonoidne komponente su izolovane iz filtrata uz pomoć FC reagensa koristeći istu
metodu spektrometrije koju smo koristili za određivanje totalne koncentracije fenola. Neflavoidni
sadržaj bio je izražen kao miligram pirokatehola po gramu suve mase uz pomoc pirokteholnog
koeficijenta. Svi primeri su analizirani u 3 kopije. Sadržaj flavonoida je odredjen iz ostatka
ukupnog fenola i sadržaja neflavonoida. Sadržaj falvonoida je izražen u mg pirokatehola po mg
ekstrakta. Svi primeri su anaizirani u 3 kopije. Sintetička galna kiselina je upotrebljena za
uporedne analize.

7. Genotoksičnost

Test polno-vezanih recesivnih letala za mutagenezu (SLRL test) je izveden u laboratoriji

sa zalihama

Drosophile melanogaster

(dobijena iz Švedske). Canton S- linija mušica, sa

normalnim fenotipom (divlji tip), dok Basc linija mušica karakterisana individualnim
homozigotom za X hromozom, balanser koji nosi 3 genetska markera:Bar (B), koji proizvodi uski
oblik očiju u homo i hemizigotnim uslovima i bubrežasti oblik očiju kod ženki heterozigota
(karakter se može smatrati delimično dominantnim). White-apricot (w

), koji menja crvenu boju

očiju u svetlo narandžastu i izražava se kod homozigotnih ženki i hemozigotnih mužjaka. Scute
(sc), koji imaju mutaciju, koja smanjuje broj čekinja na grudnom košu (data mutacija je povezana
sa mutacijom, inverzijom dugog kraka hromozoma, neophodnog za prekidanje krosing overa,
koji bi mogao da promeni postojeće kombinacije gena na tretiranom hromozomu.

Zalihe se održavaju i eksperimenti se obavljaju pod kontrolisanim, optimalnim uslovima (t =
25ºC, rela-tivna vlažnost= 60%, 12/12 h svetlo/tamni režim) na standardnom medijumu
nutrijenata za

Drosophilu

(kvasac, brašno, agar, šećer i nipagin, za sprečavanje pojave gljivica i

infekcija.

8. Procedura testa

3 dana stari Canton S mužjaci (test grupa 1, N=30), stavljaju se u prazne flaše, na 5h pre

tretmana, onda se prenose u druge boce sa hranom, koji sadrže i filter papir sa 5% ekstratom
metanola na 24h. U toku drugih 24h, na standardnom medijumu za oporavak, svaki mužjak je
uparen sa 3 Basc ženkama u bocama, koji će dati leglo I. Dva dana kasnije, mužjaci se prebacuju
na novi set bočica, koje sadrže 3 ženke Basc linije (koje će dati leglo II). Nakon 3 dana, mužjaci
se opet prebacuju u nove i sveže boce, u kojima se nalaze 3 ženke (daće leglo III). Ovi mužjaci
ostaju tu 3 dana i nakon toga bivaju premešteni. Ženke ostaju same 5 dana da bi izlegle jaja i
nakon toga bivaju premeštene.
Druga grupa individua iste starosti (test grupa 2, N=15 mužjaka), tretirani 5% sintetskom galnom
kiselinom , u razblaženju sa 1% saharoze, (test grupa 3, N=30 mužjaka) koji služe kao negativna
kontrola (Lewis and Bacher, 1968).

Nakon pojave F1 u sve 3 test grupe, dozvoljenog bratsko-sestrinskog parenja u nekoliko dana, 10
ženki iz bočice pojedinačno prebaciti u nove bočice. Svaka bočica će dati potomstvo sa tretiranim
X hromozomom. U F2 su svi fenotipovi postigli slaganje u boji i obliku očiju. Odsustvo divljeg
tipa mužjaka ukazuje na prisustvo recesivnog letala izazvane test supstancama. Kompletan broj
tertiranih X hromozoma, jednak je zbiru smrtonosnih i nesmrtonosnih kultura i učestalost
seksualno povezanih recesivnih letala, je izračunat iz odnosa između broja smrtonosnih kultura u
ukupnom broju tertiranih X hromozoma. Značaj procentualne razlike letalnih kultura određen je
testiranjem za velike, nezavisne uzorke. (Petz,1985).

Fenolna jedinjenja mogu direktno doprineti antioksidantnosti. (Duh et al., 1999). Predlaže se da
polifenolna jedinjenja imaju inhibitorne efekte na mutagenezu i kancerogenezu kod ljudi i da je
preporučljivo da se u ishranu ubaci voće i povrće tj. da se dnevno ubaci oko 1 g polifenolnih
jedninjenja. (Tanaka et al., 1998; Yoshida et al., 2000; Tsuda et al., 2004). Od alkoholnog
ektsrakta

C.coggygria

, galne kiseline izolovani su derivati izolovani su metil galat i pentilgalil

glukoza. Polifenolna kiselina i njeni derivati su biloški aktivne komponente sadržane u više
biljaka. (Kahkonen  et  al., 1999; Lee  et  al., 2000). Oni su rasprostranjeni u hrani i piću biljnog
porekla,kao što su čaj i vino. Mnogo biljaka ima potencijalnu antioksidantnu aktivnost. Galna
kiselina je je najači prirodni antioksidant.(Aruoma et al., 1993; Heinonen et al., 1998; Khan et al.,
2000;  Zheng  and  Wang,   2001).     On   je   prijavljen   kao   slobodni   radikal,   kao   i   induktor
diferencijacije apoptoze u leukemiji, raka pluća kao i u normalnim ćelijama limfocita. Nekoliko
biljnih vrsta koje poseduju anti-rak atktivnost su već otkrivene jedna od njih je

C.coggygria

Galna kiselina produkovana iz ove biljke je pokazala selektivnu citotoksčnost protiv ćelija
tumora. (Isuzugawa et al., 2001).

U ovom radu ispitali smo genotoksičnost ekstrakta metanola i galne kiseline iz biljke C.coggygria
koristeći kratak test za detekciju mutagenosti uin vivo uslovima. Naši rezultati ukazuju što se vidi
i iz Tabele 2., da komponente 5 % ekstrakta metanola

C.coggygria

dovode do indukovane

smrtonosne mutacije na sexualno povezanim recesivnim X hromozoma na Drospholu
melanogaster ( prva grupe) u sva tri legla (I,II,III). Upotrebili smo sintetičku galnu kiselinu za
uporednu analizu (test grupa 2). Za ovu polifenolnu kiselinu je jasno pokazano da je genotoksična
i da indukuje značajno povećanje mutagenosti u oba postmejotička stupnja i premejotićka stupnja
germinatvne ćelijske linije kod eukaritskih ćelija Drosophile melanogaster.

Tabela 2. Frekvencija mutacija dobijena SLRL testom nakon tretiranja Drosophile melanogaster
ekstraktom metanola dobijenog iz biljke C.coggygria i veštačke galne kiseline

(Stanić S., Matić S.,Solujić S., and Milošević T , 2009)

Reference

Aruoma, O. I., Murcie, A., Butler, J., and B. Halliwell (1993). Antioxidant and pro-oxidant
properties of herbs. J. Agr. Food Chem. 41, 1880-1885

Baricevic, D., and T. Bartol (2000). The biological/pharmacological activity of the Salvia genus,
In: Pharmacology. Sage. The Genus Salvia (Ed. S. E. Kintzios), 143-184. Harwood Academic
Publishers, Amsterdam.

Demirci, B., Demirci, F., and K. H. Baser (2003). Composition of the essential oil of Cotinus
coggygria Scop. from Turkey. Flavor Fragr. J. 18, 43-44.

Drug. Metab. Pharmacokinet. 19, 245-263.

Faried, A., Kurnia, D., Faried, L. S., Usman, N., Miyazaki, T., Kato, H., and H. Kuwano (2007).
Anticancer effects of gallic acid isolated from Indonesian herbal medicine, Phaleria macrocarpa
(Scheff.) Boerl, on human cancer cell lines. Intern. J. Oncol. 30, 605-613.

Grieve, M. A. (1971). Modern Herbal, 779-781. Dover Publications Inc., NY.

Hatano, T., Redamatsu, R., Mori, A., Fujita, Y., and E. Yasuhara (1989). Effect of interaction of
tannins with co-existing substances. VI. Effects of tannins and related polyphenols on superoxide
anion radical and on DPPH radical. Chem. Pharm. Bull. 37, 2016-2021.

Heinonen, I. M., Lehtonen, P. J., and A. I. Hopia (1998). Antioxidant activity of berry and fruit
wines and liquors. J. Agr. Food Chem. 46, 25-31

Huang, K. C. (1999). The Pharmacology of Chinese Herbs, 193-194. CRC Press.

Isuzugawa, K., Ogihara, Y., and M. Inoue (2001). Different generation of inhibitors against gallic
acid-induced apoptosis

Josifović, M., Stjepanović, L., Janković, M. M., Gajić, M., Kojić, M., and M. Diklić (1973). Flora
of Serbia, 58. Serbian Academy of Sciences, Belgrade

Kahkonen, P. M., Hopia, A. I., Vuorela, H. J., Rauha, J. P., Pihlaja, K., Kujala, T. S., and M.
Heinonen (1999). Antioxidant activity of plant extract containing phenolic compounds. J. Agr.
Food Chem. 47, 3954-3962.

Khan, N. S., Ahmad, A., and S. M. Hadi (2000). Antioxidant pro-oxidant properties of tannic
acid and its binding to DNA. Chem. Biol. Interact. 125, 177-189.

Novaković, M., Vučković, I., Janaćković, P., Soković, M., Tešević, V., and S. Milosavljević
(2007). Chemical composition, antibacterial and antifungal activity of the essential oils of
Cotinus coggygria from Serbia. J. Serb. Chem. Soc. 72, 1045-1051.
.

Lee, M. W., Lee, Y. A., Park, H. M., Toh, S. H., Lee, E. J., Jang, H. D., and Y. H. Kim (2000).
Antioxidative phenolic compounds from the roots of Rhodiola sachalinensis. Arch. Pharm. Res.
23, 455-458.

Mitić, D., Vuković-Gačić, B., Knežević-Vukčević, J., Berić, T., Nikolić, B., Stanković, S., and D.
Simić (2001). Natural antioxidants and their mechanisms in inhibition of mutagenesis, In:
Molecular and Genetic Interactions Involving Phytochemicals (Eds. M. Kreft and V. Škrabanja),
67-74. Univ. Ljubljana and Slovenian Academy of Sciences and Arts, Ljubljana

Petz, B. (1985). Osnovne statističke metode za nematematičare. SNL, Zagreb, Croatia

Stanić S., Matić S.,Solujić S., and Milošević T ( 2009). Genotoxicity testing of the methanol
extract of the plant

Cotinus coggygria

and galic acid on

Drosophila melanogaster

. Arch. Biol.

Sci., Belgrade, 61 (2), 261-266

Stammati, A., Bonsi, P., Zucco, F., Moezelaar, R., Alakomi, H. L., and A. von Wright (1999).

Tanaka, M., Kuei, C. W., Nagashima, Y., and T. Taguchi (1998). Application of antioxidative
millirad reaction products from histidine and glucose to sardine products. Nippon Suisan
Gakkaishi 54, 1409-1414.