Genetika bakterija mliječne kiseline

Genetika bakterija mliječne kiseline

Geni koji šifriraju sve esencijalne, katabolitičke i biosintetičke aktivnosti ćelija se nalaze u hromosomima. Zato znanje o strukturi i organizaciji hromosoma u bakterijama mliječne kiseline ima fundamentalan značaj i primjenljivu vrijednost za mliječnu industriju. Nedavna napredovanja u tehnologiji mapiranja hromosoma i u izvorima sekvenciranja nukleotida je potaknulo interest za analizu genoma bakterija i hromosomi mliječnih bakterija sigurno nisu iznimka.
Napore da se karakteriziraju hromosomi bakterija mliječne kiseline su ranih 1970-ih i 1980-ih poduzeli naučnici koji su koristili kinetiku renaturacije DNK-DNK da procijene veličinu genoma (u daltonima) na En. Faecalis, Lc.lactis i patogenim streptokokoma (Bak i suradnici, 1970; Jarvis i Jarvis, 1981). Klasične metode za izmjenu gena kao što je transdukcija i konjugacija (vidjeti dio III.A i III.C) nisu prikladne za mapiranje hromosoma kod bakterija mliječne kiseline, tako da detaljnije studije genoma nisu bile izvodljive do pronalaska tehnologije pulsirajućege električno polja gel-elektroforezom (PFGE) ranih 1980-ih godina (Le Bourgeois i suradnici, 1993). Ova metodologija omogućava da se pročiste relativno nedirnuti bakterijski hromosomi, digestiraju sa rijetkim rezanim ograničenim endonukleazama, a onda riješi problem proizvoda ograničenja velike molekularne težine elektroforezom u obrnutom električnom polju. Ako se koriste standardi odgovarajuće veličine u gelu, sumiranje individualnih restriktivnih fragmenata nakon PFGE postaje brzo i relativno tačno sredstvo za procjenu veličine genoma. Ovim pristupom prikupljene su procjene veličina za sojeve više od 15 vrsta bakterija mliječne kiseline. Ovi podaci pokazuju da bakterije mliječne kiseline kao druge nutritivno zahtjevne eubakterije imaju relativno male (približno 1.8 do 3.4 megabazna para) hromosome (Davidson i suradnici, 1996). Jedna od praktičnih opažanja nastala ovim radom jeste da su polimorfizmi restriktivnih fragmenata zajednički za PFGE profile iz različitih sojeva istih vrsta bakterija mliječne kiseline. Ovaj pronalazak je doveo do toga da se PFGE koristi kao oruđe za uzimanje otisaka DNA za identifikaciju sojeva i za evaluaciju roda sojeva (Le Borugois i suradnici, 1993). Drugi važan ishod PFGE tehnologije je bila njegova upotreba, kombiniranjem sa drugim procedurama kao što je Južna hibridizacija sa specifičnim genskim sondama, da se prikupe skromne fizičke i genetičke mape hromosoma bakterija mliječne kiseline.
Ova strategija je korištena da se naprave mape za hromosome nekoliko industrijski važnih bakterija mliječne kiseline, uključujući Lc.lactis (Davidson i suradnici, 1995; Le Borugois i suradnici, 1992a; Tulloch i sur., 1991), O.oeni (Ze-Ze i sur., 1998) i S.thermophilus (Rousell i sur., 1994), i za mnoge pategnske streptokoke (Dimitrij i sur., 1998; Gasc i sur, 1991; Hantman i sur, 1993; Suvorov i Fereti, 1996).
Ove mape su potvrdile da se kod individualnih vrsta pa čak i sojeva mogu razlikovati organizacija i veličina genoma, i pokazuju da sve bakterije mliječne kiseline karakterizirane do danas imaju jedinstven i cirkularan hromosom.

Konačno, PFGE tehnologija je također pomogla u proučavanju geometrije hromosoma i intraspecifičnih polimorfizma kod Lc.lactis i S.thermophilus. Ova istraživanja su identificirala intraspecifične genomske polimorfizme koje su nastale inverzijom, umetanjem, brisanje i translokacijom DNK i pružila su dokaz da su IS elementi bili uključeni u mnoge od ovih radnji (Davidson i sur., 1996; Leblond i Decaris, 1998; Roussel i sur., 1997). Kako je primijećeno u dijelu II.B dodatna istraživanja su potvrdila da su velike inverzije genoma kod hromosoma Lc.lactis ML3 ustvari nastale homolognom rekombinacijom između IS905 elemenata.

Kako je naznačeno u prethodnim paragrafima razvoj i komercijalizacija PFGE tehnologije je pomogla nastajanje nove mikrobiološke discipline čiji je predmet interesa strukturalna, funkcionalna i komparativna analiza bakterijskih genoma.
Iako je PFGE analiza još važan dio istraživanja genoma najuzbudljiviji i inovativniji rad u ovom brzo rastućem polju sada potiču analize nukletoidskih sekvenci potpunih genoma.

Komparativna genomika

Kompiliranje i označavanje cjelokupne sekvence genoma je revolucioniziralo bakteriologiju i mikrobialnu genetiku i stvorilo je skoro nezamislive prilike da se istraži bakterijska evolucija, genetika, psihologija i metabolizam. Od 1995 godine je objavljen cjelokupni nukleotidni niz za više od 30 različitih mikrobialnih genoma i izvode se projekti sekvencioniranja za preko 100 drugih vrsta ( vidjeti http:/ /www.tigr.org/tdb/mdb/mdb.html). Dramatičan rast u istraživanju sekvence genoma je uveliko rezultat tehnoloških poboljšanja kod automatiziranih DNK sekvencera, alata molekularne biologije, ličnih računara, i kompjuterskog softvera koji sada omogućavaju da se čak i male bakterije mliječne kiselineoratorije uključe u projekat genomskog projekta (Frangeul i sur., 1999).
Zbog očitih razloga, većina projekata sekvenciranja mikrobialnog genoma su fokusirana na vrste koje imaju klinički značaj za ljude. Zbog toga nije iznenađenje da su projekti sekvenciranja među bakterijama mliječne kiseline izdvojili nekoliko važnih patogena u ovoj grupi ( npr., En. faecalis, S. mutans, S. pyogenes, and S. pneumoniae).
Bez obzira na to, nedavno je prijavljeno sekvencioniranje malih zaliha cjelokupnog genoma Lc.lactis od strane Bolotina i suradnika (1999), i izvode se projekti sekvencioniranja genoma za druge važne bakterije mliječne kiseline, uključujući Lc.acidophilus i Lb.hevleticus.
Ne može se dovoljno naglasiti vrijednost informacija i istraživanja o sekvenci genoma i iz razreda prehrambenih i patogenskih vrsta bakterija mliječne kiseline. Takvo iscrpno znanje će zadužiti industriju i naučne krugove sa novom moći da se odrede sredstva kojima su bakterije evoluirale, s kim interaguju, i kako odgovaraju na okoliše u mlijeku i siru. Važno je naglasiti da su označavanje i sekvencioniranje samo prvi koraci u funkcionalnom istraživanju genoma.
Fiziološka uloga i regulacija većine utvrđenih ORF (DNK niz koji ne sadrži STOP-kodone )mora još biti potvrđena ili identificirana, i ovaj zadatak može da traje nekoliko decenija. Pored toga, brzina kojom istraživači genoma bakterija mliječne kiseline mogu da napreduju će također ovisiti od vremena i stepen do kojeg genomske sekvence postaju dostupne široj naučnoj zajednici. Unatoč tome, fundamentalne i primjenljive koristi istraživanja genoma za mliječnu industriju su previše brojne, i mnoge vjerovatno još nisu poznate.