Pronalaženje ćelija kancera u tkivima koristeći AFM

Pronalaženje ćelija kancera u tkivima koristeći AFM
(AFM-atomska mikroskopija)
UVOD
Najzastupljenije vrste tumora danas su : tumor dojki, prostate i creva, kao i neki manje zastupljeni ali mnogo agresivniji a to su : tumori pankreasa i melanomi na koži. Iako se mnogo truda ulaže za samu dijagnostiku tumora i njihovo lečenje, jako ih je teško izlečiti, posebno zbog činjenice da velika većina tumora bude otkrivena tek u poodmakloj fazi. Pronalaženje ćelija kancera se bazira na biološkom opisu postignutom na morfološkoj osnovi. Pokazalo se da je najvažniji faktor koji će ishod biti jeste rana dijagnostika, s’toga je posvećena velika pažnja otkrivanju novih metoda u dijagnostikovanju. Osnovni problem vezan za kancer predstavlja metastaza-to je sposobnost primarnih ćelija tumora da migriraju kroz krvne sudove putem krvi i njene limfe , i da na taj način formiraju tumore na mnogobrojnim ali i na udaljenim lokacijama u telu. Zahvaljujući studijama koje se bave pokretljivošću ćelija raka i njihovom invazijom, pomoglo je da se bolje razumeju osobine malignih transformacija. Dokazano je da je napredak kancera uslovljen reorganizacijom ili poremećajima citoskeleta, što je praćeno mnogobrojnim molekulskim promenama koje utiču na osobine ćelija. Već duže vreme je poznato da postoji veza između ćelija, njihove sposobnosti da se deformišu i različitih bolesti. Određivanje ’’ krutosti ’’ ćelija u smislu progresije kancera omogućava efektivnije pronalaženje promena vezanih za tumore. Metode koje se danas koriste za merenje deformabilnosti samo jedne ćelije obuhvataju metode kao što su : aspiracija mikropipete(micropipette aspiration), uvrtanje magnetne trake (magnetic bead twisting), optičke pincete (optical tweezers), atomska mikroskopija (atomic force microscopy). Prednost ovih metoda jeste mogućnost posmatranja žive ćelije na jednom ćelijskom nivou u tečnoj sredini koja oponaša prirodne uslove. Pokazano je da ćelije koje se nalaze u poodmaklim stadijumima kancera imaju veću deformabilnost. Metoda atomske mikroskopije je primenjivana za izučavanje tkiva uzete od pacijenata sa mnogobrojnim kancerima viših stadijuma. Ispitivanja koja su sprovedena unutar i van tumornih oblasti pokazali su različite rezultate ali se za sva istraživanja postavila jasna granica između zdravih i oblasti koje su zahvaćena tumorom.

Materijali i metode
Ćelijske kulture
Najčešće proučavane ćelijske kulture su : beztumorne ćelije, tkiva prostate, sakupljene od epitalnih ćelija uzgajanih na zdravom tkivu. Adenokarcinom (kancer epitela koji potiče iz tkiva žlezda) prostate prouzrokovan metastazom kostiju, metastaze tumora prostate potekle od metastaza mozga, metastaze tumora prostate prouzrokovana metastazom leve strane supraklavikularnog limfnog čvora, ćelijska kultura uzeta sa zdravog tkiva dojki… U zavisnosti od tipa ćelije morali su biti primenjivani odgovarajući uslovi kulturama u kojima su gajeni.
Uzroci tkiva
Sakupljana su u toku operacija, analizirana od strane patologa tako da su sveži uzroci tkiva odvojeni i stavljani u odvojene epruvete napunjene fiziološkim rastvorom , nakon čega se nose na dalje ispitivanja sprovođena na AFM-u.
Priprema tkiva za ispitivanja na AFM-u
Za ispitivanja na AFM-u ćelije su sakupljene sa više različitih delova tkiva nakon čega su uzgajane na staklenim pločicama uronjenim u odgovarajuću tečnost. Nakon što te uzgajane ćelije formiraju u površinski sloj zajedno se sa staklenom pločicom postavljaju u AFM skener nakon čega se merenje vrši dva do tri sata na sobnoj temperaturi na kojoj zadržavaju svoju vitalnost. Uzroci tkiva se pripremaju po propisanim uslovima tako što se od svakog svežeg dela tkiva odseca veliko parče u tečnim uslovima koristeći dva sečiva. Ispitivanje prikupljenog tkiva moraju se izvesti u istom danu . Ispitivanje u kojima se koristi AFM deo tkiva mora biti dimenzija 6mm X 2mm X 2mm, i zalepljeno na staklenu pločicu uz pomoć dve kapi cijanoakrilnog lepka koji se postavlja sa obe strane uzorka.
Atomska mikroskopija
Merenja elastičnosti izvode se u tečnim uslovima koristeći dva AFM-a pri čemu oba rade u režimu spektroskopije. Za potrebe ovog eksperimenta jedan uređaj je bio proizvod kućne radinosti dok je drugi bio kupljen. Nezavisno od toga koji se model AFM-a koristio, sve krive sila tj. zavisnost između položaja skenera i ugiba konzole zabeležen je na živim ćelijama u uslovima kulturnog uzgajanja na sobnoj temperaturi. Izmereno je oko 30 ćelija. Svaka ćelija je locirana koristeći optički sistem koji je integrisan u AFM-u , i konzola uređaja je postavljena tako da bude iznad samog centra ćelije tj. njenog jezgra. Nakon toga se bira mapa koja se sastoji od unapred definisanih broja tačaka što odgovara skeniranom području veličine od 10 do 12 µ m. Broj tačaka zavisi od vrste mikroskopa.