Test za bakterijske endotoksine – LAL test

Uvod
Uzročnici toksičnih reakcija koje se pripisuju kontaminaciji farmaceutskih proizvoda pirogenima su najčećše endotoksini (lipopolisaharidne prirode) koji potiču iz gram-negativnih mikrooganizama. Pirogena aktivnost ovih endotoksina je mnogo veća od većine drugih pirogenih supstanci. Opšte potvrđeno je da odsustvo bakterijskih endotoksina u proizvodu ukazuje na odsustvo pirogenih komponenti, pod uslovom da se prisustvo pirogenih suspstanci koje nisu endotoksini može isključiti.
Neki faktori mogu da maskiraju prisustvo endotoksina u proizvodu onemogućavajući reakciju između endotoksina i lizata amebocita. Da bi se test na uzorku mogao smatrati validnim, prethodno moraju biti dostupni podaci o sledećim aspektima:
1. potrebno je utvrditi pogodnost materijala koji se koristi za test (osigurati odsustvo endotoksina u LAL vodi i drugim reagensima, provera osetljivosti lizata amebocita po specifikaciji proizvođača);
2. osetljivost lizata amebocita se određuje u prisustvu i odsustvu proizvoda koji se ispituje, koji može da ometa test, i razlika između dve vrednosti za osetljivost ne treba da bude značajna.
Kada proizvod koji se ispituje ne prođe test, dozvoljeno je ponavljanje testa. Kada proizvod očigledno ne zadovoljava zahteve, uzrok mogu da budu greške u pripremi ili razblaživanju ili druga slučajna kontaminacija od strane analitičara.
Test za bakterijske endotoksine (LAL test) se izvodi tako rastvoru lizata amebocita potkoričastog račića (Lymulus polyphemus), ili blisko srodnih vrsta (npr. rod Tacypleusi), doda rastvor koji sadrži endotoksine i pritom se javlja zamućenost, precipitacija ili geliranje smeše. Brzina reakcije zavisi od koncentracije endotoksina, pH i temperature. Za reakciju je potrebno prisustvo određenih dvovalentnih katjona, koje obezbeđuje lizat.

Priprema za test
Prema monografiji preparat se smatra ispravnim ako koncentracija endotoksina nije veća od granične koncentracije endotoksina, što se jedino može potvrditi dokazivanjem da je koncentracija endotoksina u proizvodu manja od granične koncentracije endotoksina. Test se izvodi na način kojim se izbegava kontaminacija mikroorganizama.
Pre izvođenja ovog testa neophodno je:

• utvrditi da oprema koja se koristi ne adsorbuje endotoksine,
• osetljivost lizata,
• odsustvo faktora interferencije.

Oprema
Reagensi i referentni preparati koji se koriste u testu su:

• standard endotoksina BRP kalibrisan u i.j. poređenjem sa Internacionalnim Standardom;
• lizat amebocita koji se rekonstruiše kao što je navedeno u uputstvu proizvođača;
• voda za LAL koja se može pripremiti trostrukom destilacijom vode u aparatu koji je opremljen efikasnim delom koji sprečava ulazak čestica ili drugih sredstava kako bi se dobio traženi kvalitet (daje negativan rezultat u propisanim uslovima testa na endotoksine u preparatu koji se ispituje)
• 0,1 M hlorovodonična kiselina za LAL i 0,1 M natrijum-hidroksid za LAL koje se dobijaju iz hlorovodonične kiseline R, odnosno natrijum-hidroksida R, uz pomoć vode za LAL. Reagens je pogodan ukoliko daje negativan rezultat u uslovima testa posle podešavanja na pH 6,5 – 7,5.

Osetljivost lizata
Pripreme se najmanje četiri identične serije dvostrukog razblaženja standarda endotoksina BRP da bi se dobile koncentracije od 2λ, λ, 0,5λ i 0,25λ, gde je λ navedena osetljivost lizata koji se koristi. Negativan rezultat mora da se dobije i sa najvećim razblaženjem svake serije. Pregledaju se razblaženja i negativan kontrolni rastvor koji se sastoji od vode za LAL. Izračuna se prosek logaritama najniže koncentracije endotoksina u svakoj seriji razblaženja u kojoj je nađen pozitivan rezultat. Antilogaritam tog proseka daje izračunatu osetljivost lizata. Ako se ona ne razlikuje za više od faktora 2 od navedene osetljivosti, navedena osetljivost je potvrđena i koristi se u svim testovima koji se izvode sa tim lizatom.

Faktori interferencije
Postupa se kao što je propisano pod „Osetljivost lizata“ , ali se za pripremanje razblaženja standarda endotoksina BRP koriste netretirani uzorci preparata u kojima endotoksini ne mogu da se detektuju. Ovi uzorci se koriste pri maksimalnom validnom razblaženju (MVD) koji se izračunava iz izraza:

• maksimalno validno razblaženje = granična koncentracija endotoksina / osetljivost lizata
• obe vrednosti se izražavaju u i.j./ml endotoksina.