2
2.0 USLOVI ZA ODRĐIVANJE AKTIVNOSTI ENZIMA
Optimalni uslovi za određivanje aktivnosti enzima propisani su u metodama
koje se koriste. Međunarodna unija za biohemiju (International Union of
Biochemistry, IUB) 1961. godine dala je preporuku da se aktivnost enzima meri na
25°C. Kasnije (1979. godine) međunarodna federacija za kliničku hemiju
(International Federation of Clinical Chemistry, IFCC) je preporučila temperaturu
od 30°C kao optimalnu za određivanje katalitičke aktivnosti fermenata. Nekada se
za inkubaciju koristi temperatura od 37°C, koja je fiziološka za organizam čoveka,
ali su tada uslovi za merenje enzimske aktivnosti manje stabilni, jer se enzimi brže
denaturišu tokom procedure. Izuzetno se pri ispitivanju termostabilnih enzima,
mogu koristiti i više temperature(na primer 45-50°C za ALA dehidratazu; ili 56-
60°C za alkalnu fosfatazu iz placente)
Pri izboru pufera kojim se obezbeđuje optimalni pH, potrebno je da njegove
komponente ne sadrže jone koji deluju kao inhibitori enzima, niti sastojke koji se
stvaraju tokom enzimske reakcije (na primer, neorganski fosfor pri ispitivanju
fosfataza) Takođe je važno da sastojci pufera ne interferiraju hemijski sa
supstratom, produktom ili indikatorskim reagensom. Fostatni pufer se izbegava u
enzimskim reakcijama, jer pogodan medijum za razmnožavanje mikroorganizma.
Ukoliko su joni Ca aktivatori enzima koji se analizira, ne sme se koristiti EDTA
kao antikoagulans pri uzimanju krvi, a ako su inhibitori, treba se dodati EDTA.
Ako ispitivani enzim pripada SH fermentima, u reakcioni medijum treba dodati
neko sulfhidrilno jedinjenje (cistein, glutation, ditiotreitol itd.).
3
Ukoliko ferment sadrži koenzim koji se za apoenzim vezuje labavim
hemijskim vezama (NAD, NADP), potrebno je te supstance dodati u reakcionu
mešavinu. Pri tome valja znati da su piridin-koenzimi dosta nestabilni i da se
njihova postojanost smanjuje pod uticajem svetlosti i povišene temperature.
NADH u supstanci je vrlo higroskopan, pa ga treba zaštiti od vlage.
Sve hemikalije koje se upotrebljavaju pri određivanju aktivnosti enzima mora
da budu analitičkog stepena čistoće, a voda koja se koristi za spremanje rastvora
treba da je sveže redestilovana ili dejonizovana.
Naročita pažnja mora da se obrati na uzimanje i čuvanje biološkog materijala
u kome se određuje katalitička aktivnost fermenata. Pri uzimanju krvi, za dobijanje
krvne plazme treba da se upotrebe oni antikoagulansi koji ne inhibiraju enzime čija
se aktivnost meri, a plazma (ili serum) mora da se što je moguće pre odvoji od
ćelija krvi. Enzimi su termolabilni, pa mnogi od njih gube brzo svoju aktivnost ako
se uzorci drze na sobnoj termperaturi. Biološki materijal (krv, plazma, serum,
telesne tečnosti tkiva) su pogadno tle za razvoj mikroorganizama,a sem toga u
njemu se vrši autoliza pod dejstvom sopstvenih (ili bakterijskih) fermenata, pa je
potrebno da se blagovremeno obavi analiza ili da se uzorci zamrznu. Hemolizovani
serum (plazma) po pravilu nije pogodan za enzimska ispitivanja, jer se u njemu
povećava aktivnost onih fermenata koji su u eritrocima prisutni u većoj
koncentraciji nego u plazmi(transaminaze, LDH, kisela fosfataza), a sam
hemoglobin ometa fotometriranje, jer apsorbuje svetlost u vidljivom spektru (sa
maksimalnom apsorpcijom pri 405nm). Ikterična plazma (serum) sadrži veće
koncentracije žučnih boja koje predstavljaju smetnju pri fotometriranjum pa zato
za svaki uzorak mora da se uradi posebna kontrola: Lipemična plazma (serum),
koja je zamućena zbog sadržaja veće količine lipida, ometa merenje apsorpcije pa
je potrebno da se izvrši ekstrakcija lipida, ili treba raditi kontrolnu probu za svaku
analizu.
