je vrlo jednostavan. To je postupak sinteze DNK tokom više puta ponavljanih ciklusa
udupljavanja tako stalno uvećavanog broja raspoloživih DNK, a sve uz pomoć

enzima

imenu

DNK polimeraza

. To znači da će oba jednolančana komplementarna niza koji čine

DNK dupli helix u određenoj poziciji istovremeno početi sintetizirati novi komplementarni
niz. Za efikasnu primjenu metode važno je dijelove sekvenci DNK poznavati. Polimeraze
lančana reakcija odvija se u termocikleru. Taj uređaj zagrijava i hladi reakcione posudice koje
se nalaze u njemu i to vrlo preciznim temperaturama i dužinama programiranih ciklusa. Da bi
se spriječilo isparavanje sve će biti hermetički upakirano ili će reakcioni materijal biti
prekriven slojem ulja. Da bi se izbjeglo gubljenje minimalne količine reakcionog materijala
kondenzacijom na poklopcu, isti će biti zagrijavan na nešto preko 100°C.

Sadržaj





2 Laboratorijska iskustva rada sa PCR-om



3 Nested PCR



4 Multiplex PCR



5 Amplifikacija dugih DNK fragmenata (>5kb)



6 Primjena PCR metode



7 Dalji razvoj PCR-a

Standardni PCR

[

uredi

]

Ovaj članak ili odjeljak

nije wikipediziran

(

Rasprava

)

Tekst članka treba

preurediti u wikitekst

. Potom uklonite ovaj

predložak.

Termocikler

Sve što je potrebno za jedan PCR je:

- Termostabilna DNK polimeraza;

- Kalupna DNA

- Dvije odgovarajuće oligonukleotidne početnice

primer

;

- Pufer karakterističan za upotrebljenu polimerazu;

- dNTP

Nukleotidi

: A, T, C i G;

Osnovni uvjeti svih PCR programa su:

1. Početna denaturacija traje 5 minuta i odvija se pri temperaturi od najčešće 94°C. Pritom se
razdvajaju lanci dvostruke zavojnice kalupne molekule DNA - dolazi do denaturacije
molekule DNA. Temperatura će zatim biti snižena na 55°C da bi se omogućilo hibridiziranje -
prijanjanje (annealing) oligonukleotidnih početnica (primera) na denaturiranu DNA
(jednonize). Potom će temperatura biti povišena na 72°C. To je optimalna temperatura za
Taq-polimeraze, stoga će se njome potaći rad polimeraze, odnosno produljivanje lanaca od
početnica u smjeru 5'-3' sve dok se ne izgradi nova dvolančana molekula DNA koja je
potpuno identična početnoj molekuli DNA. Pošto se izgradnja molekula događa na oba lanca
početne molekule DNA, tim će procesom dakle nastati dvije dvolančane molekule DNA - broj
će se udvostručiti. Postupak možemo u cijelosti u cilju umnožavanja početne DNK, stalno
ponavljati. Broj novonastalih DNK će se uvećavati geometrijskom progresijom ( 1, 2, 4, 8, 16,
32, 64,...).

2. Trideset ciklusa koji slijede se dešava i to svaki:

  DENATURACIJA (denaturation) 30 sec. pri 94°C
  PRIJANJANJE (annealing) 30 sec. pri 55°C
  PRODULJIVANJE (elongation) 90 sec. pri 72°C

3. Na kraju ide završno produljivanje lanaca u trajanju od 5 min pri temperaturi od 72°C

4. Reakcija će konačno biti ohlađena na 4°C.

Laboratorijska iskustva rada sa PCR-om

[

uredi

]