Genotoksično testiranje metanolskog ekstrakta biljke Cotinus Coggygria galne kiseline na Drosophila melanogaster

1. Uvod

U ovom radu je ispitivan genotoksični efekat metanolskog estrakta biljke Cotinus coggygria i galne kiseline sintetičkog porekla metodom SLRL testa . Uočeno je povećanje frekvencije polnovezanih recesivnih letalnih mutacija kod ispitivanih grupa mužjaka eukariotske vrste Drosophila melanogaster, u odnosu na negativnu kontrolu što predstavlja pozitivan rezultat. Uočene su značajne razlike za I, II i III leglo i ali sva 3 legla pokazuju podjednaku osteljivost ćelija premejotičkog i postmejotičkog stupnja spermatogeneze na komponente metanolskog ekstrakta i galnu kiselinu sintetičkog porekla.

2. O SLRL testu

SLRL je kratkotrajan i vrlo efikasan test i vrlo senzitivan test sa procentom korelacije 81%-91%.Ovaj test meri frekvencu genskih mutacija i malih delecija u germinativnim ćelijama mužjaka D.melanogaster. Pokriva recesivne letalne mutacione promene na oko 800 gena smeštenih na X hromozomu kod D. Melanogaster . Nasledne promene se mere na netretiranom potomstvu pa se samim tim dobija stvarni nasledni efekat.

2.1 Princip testa

Recesivne letalne mutacije dovode do uginuća jedinki koje ih imaju u svom genotipu u homozigotnom stanju, u heterozigotu se ne ispoljava efekat recesivnog letalnog alela.
Ako se letalni alel nalazi na X hromozomu, pogođeni su mužjaci jer su oni hemizoti za letalni recesivni alel pa se muške jedinke neće izleći ako su nosioci letalnog alela!
Heterozigotne ženke preživljavaju ali polovina mužjaka potomaka takvih ženki će sigurno biti nosioci letalnog alela i neće se izleći!

Za ovaj test se koriste dve laboratorijske linije D. melanogaster:

“Oregon” (ima fenotip “divljeg tipa” i nije nosioc letalne recesivne mutacije)

“Basc” (linija koja nosi recesivne genske mutacije)
Basc – vidljivi fenotipski markeri
– Bar složeno oko
– Apricot boja očiju
– Redukovana dužina torakalnih čekinja

X hromozom je invertovan tako da formira specifičan oblik – tzv. “Basc” hromozom Inverzija sprečava da nasledne promene nastale tretmanom mužjaka budu inkorporirane u X hromozom koji potiče od ženki. Tako se sigurno X hromozom (bez promena u krosing overu) koji je izmenjen dejstvom mutagena prenosi na muško potomstvo.

2.2 Rastvaranje test supstance

U vodi ili organskom rastvaraču DMSO, aceton, etil-alkohol ili sirćetna kiselina Najčešće se koristi DMSO koji u krajnjoj koncentraciji treba biti ne više od 0.4%! U starijim izvorima piše da je gornja granica koncentracije DMSO-a u test podlozi 2% što se u poslednje vreme pokazalo kao netačno.
2.3 Hranjenje adulta test supstancom

Mužjaci se prebacuju u teglicama na čijem se dnu stavi filter papir natopljen test supstancom sa dodatkom 1% rastvora saharoze da bi se hranili narednih 24h. Za duže tretmane filter papir se menja na svaka 24h. Bitno je odrediti LC50 za test supstancu da bi se znalo sa kojom koncentracijom treba krenuti u testiranje na genotoksičnost. Preporučljivo je koristiti ½ LC50 i ¼ LC50 U slučaju da ispitivana supstanca nema toksičan efekat na jedinke onda se koristi 5% rastvor test supstance. Svaki od tretiranhi mužjaka “divljeg tipa” prebacuje se u flakone sa hranljivom podlogom zajedno sa tri nove neoplođene ženke “Basc” linije. Nakon dva-tri dana se mužjaci prebacuju u novu teglicu sa novim ženkama i postupak se ponavlja. Na taj način se formiraju tri legla.
Ženke se uvek ostavljaju još 5 dana da bi položile jaja a zatim se i one odstranjuju sa podloge.
Poznato je da nisu svi stadijumi spermatogeneze podjednako osetljivi na dejstvo genotoksičnih supstanci.
Formiranjem tri različita legla tretiranih mužjaka postiže se dobijanje gupa potomaka koje se međusobno razlikuju po tome na kom je stadijumu spermatogeneze bila germinativna ćelija pri tretmanu test supstancom, od koje je nastao spermatozoid koji je učestvovao u formiranju zigota.
Nakon izleganja F1 generacije, uzimaju se po deset parova i prebacuju se na svež supstrat da se spare i polože jaja.